1、1、至今生物技术的发展史上经历了三个浪潮，分别是？工业微生物技术，医药微生物技术，农业微生物技术2、什么是工业生物技术？ 工业生物技术是利用生化反应进行工业品的生产加工技术，是人类模拟生物体系实现自身发展需求的高级自然过程3、什么是生物炼制？ 生物炼制是利用农业废弃物、植物基淀粉和拇指纤维素材料为原料，生产各种化学品、燃料和生物基材料4、工业生物技术重大产品系列包括哪些？抗生素、用于农业和畜牧业的生物活性物质、氨基酸、核苷酸、维生素、多糖、新的多元醇新的有机酸、新的酶制剂。第二讲发酵1、发酵的定义？原本指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。广义上发酵是微生物把一些原料
2、养分在合适的发酵条件下经特定的代谢转变成所需产物的过程。2、有氧发酵与厌氧发酵的区别？介绍的产品中哪些是有氧发酵？哪些是厌氧发酵？ 有氧发酵在有氧环境中进行有氧代谢生成丙酮酸，进入 TCA 循环，产生有氧代谢产品；厌氧发酵在无氧环境中进行无氧酵解，丙酮酸继续进行代谢生成无氧代谢产品。有氧发酵产物：氨基酸、蛋白质、柠檬酸、核苷酸、抗生素。无氧发酵产物：酒精、丙酮丁醇3、发酵过程中菌体生长的阶段？原答案：调整期 对数期 稳定期 衰亡期 新答案：接种后菌体开始生长，直达到菌体的临界浓度。同时，营养物质进行分解代谢，不断的消耗，浓度明显减少，溶氧浓度逐渐的降低到一定水平，其中某一参数可能成为菌体生长的
3、限制因素，使菌体生长速度减慢，积累了相当量的某些代谢中间体，原有的酶活力下降，出现了与次级代谢相关的酶，其酶解除了控制等原因，导致菌体的生理状况发生改变，菌体就从生长阶段转入产物合成阶段。4、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵？ 分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。补料分批发酵，即称半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的方法。连续发酵是指是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程 5
4、、工业发酵的一般流程是什么？菌种的选育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵过程，下游处理即分离提纯等几个过程。第三讲工业微生物1、常用的发酵工业微生物有哪些？细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、噬菌体、藻类2、发酵工业对生产菌种的要求？能在廉价材料制成的培养基上生长，且生成的产物产量高、易于回收生长较快、发酵周期短培养条件易于控制抗噬菌体及杂菌污染能力强菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定对放大设备的适应性强菌种本身不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。3、如何筛选出生产目标产品的菌株？菌株筛选的两个关键问题？定方案采样增殖分离发酵性能测试两个关键问题：（1）分离什么和从哪里
5、分离出所需微生物（2）如何筛选分离出所需微生物4、什么是诱变育种？菌种诱变育种的方法？按照生产的要求根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌株变异，在经过筛选，而达到菌株诱变选育的目的。原种（出发菌种）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液右边处理（活菌计数）平板分离斜面培养（初筛、复筛）保藏及扩大试验5、什么是菌种保藏？方法有哪些？根据菌种的胜利生化特点，人为的创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态菌种保藏方法：斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法第四讲培养基1、什么是培养基？类型和用途？培养基是提供微生物生长繁
6、殖和生物合成各种代谢产物的所需要的。按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括氮源、碳源、无机元素、生长因子及水、洋气等。按营养物质分类:天然培养基、合成培养基和帮合成培养基按物理性状划分：固体培养基适合于菌种和孢子的培养和保存也有用于子实体的真菌类的生产液体培养基80-90%是水，配有可溶性的灬不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基半固体培养基在液体培养基中加入 0.5-0.8%的琼脂，用于鉴定细菌、观察细菌运动特性及噬菌体的效价滴度按用途划分：孢子培养基是提供菌种繁殖孢子的一种蝉蛹固体培养基种子培养基是供孢子发芽、生长、和大量繁殖菌丝体发酵培养基供菌体生长、繁殖
7、和合成产物之用2、工业微生物常用培养基？牛肉膏蛋白胨培养基是一种最广泛和最普通的细菌基础培养基高式 1 号培养基是用来分离和培养放线菌的培养基查氏合成培养基是用来分离和培养霉菌的培养基麦芽汁培养基是用来分离和培养酵母菌的培养基LB 培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L,氯化钠5g/L，PH4.7 ，适合菌种 E.coli的生长3、营养源的成份及作用，举例？碳源：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分，分为糖类（葡萄糖、淀粉糊精） 、油和脂肪（豆油猪油等） 、有机酸（柠檬酸、乙酸等） 、烃和醇类（正烷烃、乙醇等）氮源：用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物；分为有机氮源和
8、无机氮源无机盐及微量元素：对微生物的生长和产物合成有促进作用，有钾钙钠铁锰锌水：良好的溶剂，溶剂营养物质，细胞的渗透、分泌、排泄等都是以水为媒介，并且水直接参与代谢作用中的许多反应，水的比热高，是热的良导体，调节细胞的温度生长因子：微生物生长不可或缺的微有机物，如氨基酸嘌呤、嘧啶等前体：产物能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中的产量却因缴入前体而有较大的提高，如青霉素、苯乙酸、苯乙胺等产物促进剂：指那些非细胞生长所必需的营养物质，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂，如淀粉、蛋白酶等。抑制剂：在发酵过程中假如抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人
9、们所需的某种产物灬使代谢的某一代谢中间产物积累起来。例如微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，他与代谢过程中的乙醛生成加成物。4、发酵培养基选择的基本原则？a)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分b)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量灬最大利用率c)有利于提高培养物和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力d)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期e)尽量减少副产物的生成，便于产物的分离纯化f)原料价格低廉，质量稳定，取材容易g)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率降低耗能。h)有利于产品的分离纯化，尽可能减少产生“三废”的物质第五
10、讲灭菌1、什么是灭菌？培养过程中那些需要灭菌？灭菌的方法以及使用的范围？所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或物料或设备中一切有生命物质的过程培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌化学灭菌：常用的化学药剂有甲醛、氯（次氯酸钠） 、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐、臭氧射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的 射线进行灭菌。紫外线：穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒。微波灭菌射线灭菌干热灭菌：常用的干热条件为在160下保温 1 小时，不如湿热灭菌有效，一些要求保持干燥的实验器具和材料等可以用干热灭菌。湿热灭菌：利用饱和水蒸汽进行灭菌。蒸汽有很强的穿透力，且在冷凝时放出大量冷凝热，易使蛋白质凝固而
11、杀灭各种微生物。培养基、发酵设备与管理的灭菌以及实验器材的灭菌，普遍采用湿热灭菌。121,20-30min过滤除菌：利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。适用于澄清流体的除菌：空气、热敏性培养基组分；产品提取也可利用无菌过滤处理料液，获得无菌产品。火焰灭菌法物理方法：超高静压等 第六讲 种子培养1、种子？指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。2、种子质量要求。种子培养与发酵培养的目的与培养基的差异？（1）纯（2）活力旺盛（3）有足够的菌体浓度（4）要求种子培养至对数
12、生长期中后期种子培养是为了取得生机茂盛的、接种数目充足的培育物，其培养基一般用营养丰富而完全的天然有机氮源，提供种子的快速生长。发酵培养是为了生产目的产品，其培养基用的是一般培养基，并在其中缴入特定元素前体、促进剂等，进行产业化生产。3、接种龄？过于年轻或过老的种子对于发酵的影响？接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。接入种
13、子罐中的种子，随着培养时间的延长，菌丝增加，但由于基质的消耗、代谢产物的积累及菌丝体的死亡，菌丝量不再增加，而逐渐趋于老化。过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。4、接种量？对发酵的影响？接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例细菌发酵接种量较小，13%即可，真菌发酵接种量较大，抗生素发酵中大多霉菌的接种量为715% ，甚至更高。补料分批发酵中也可适当提高接种量接种量的大小取决于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来接种量大，有利于对基质的利用和产物的合成，生产菌迅速占据培养环境，减少了杂菌生长的机会接种量过多，
14、菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其它不正常情况第七讲发酵过程控制1、发酵热的来源？发酵热:发酵过程中释放出来的净热量。Q 发酵 = Q 生+ Q 搅拌-Q 蒸发-Q 显- Q 辐射生物热：由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量。其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。搅拌热：机械能转变为热能的热功当量 ,是由于搅拌带动发酵液作机械运动,造成液体之间,液体和设备之间的摩擦产生的,数量可观。蒸气热：通气时，引起发
15、酵液水分蒸发，发酵液因蒸发而被带走的热量称为蒸发热。显热：排出的气体夹带着显热辐射热：因发酵过程温度与周围环境温度不同，发酵液的部分热量通过罐体向外辐射。客观存在的大小，取决于罐内外温度差，冬天大些，夏天小些。一般不超过 5%2、温度对发酵过程的影响1.从动力学角度来看，T 升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T 升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。 1/X dX/dt = - = Ae Ea/RT A1e Ea1/RT 2. 温度通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。 3.影响生
16、物合成方向如:金色链霉菌35 时，合成四环素； 弯叶 箭叶式翻动流体的能力：箭叶式 弯叶 平叶4、夹套与蛇管在传热能力上的差异？ 夹套,传热系数为 400-630kJ/(m2h C),5m3 以下采用蛇管,传热系数为 1200-1890kJ/(m2h C),5m3 以上采用5、 气升式反应器的形式？气升式反应器与通用式发酵罐的比较与应用？ 气升环流式、塔式、空气喷射式等。 特点：1）反应溶液分布均匀 2）较高的溶氧速率和溶氧效率 3）剪切力小 4）传热良好 5）结构简单6）能耗小 7）不易染菌 8）操作和维修方便 应用： 酵母生产、单细胞蛋白生产、细胞培养、酶制剂和有机酸等发酵生产、废水生化处
17、理。6、发酵罐的几何放大计算规则？几何尺寸放大：m = V2/V1H1/D1 = H2/D2 = AH2 / H1 = D2 / D1= m1/3空气流量的放大:以 Kla=常数的原则进行放大(VVM)2/ (VVM)1 = (D1/D2)2/3 * (P2/P1) 采用单位培养液体积通气功率相等的原则P2 = P1 * (d2/d1)2.765 * ( g)2/( g)10.24第九讲 柠檬酸生产1、柠檬酸发酵生产的必要条件？糖源浓度高：120250g/L磷酸盐浓度低:0.2-1.0g/L氮源用 NH4+盐:2.0g/LpH 值低:1.6-2.2溶氧量高:金属离子浓度极低: Mn2+10-2
18、0%2、碳源、pH、金属离子的控制与机理？碳源：柠檬酸发酵需要高浓度的糖，不仅提供碳源，而且可以中和过程中产生的抑制剂PH:初始黑曲霉生长时的适宜PH 应调解在 3-7，如高于 7 则分生孢子会剧烈膨胀，甚至破裂如地狱 4.5 会强烈抑制它的发育，在 PH2.5 一以下时，分生孢子甚至不膨胀；发酵时 PH 在 2.5 一下黑曲霉发酵糖的常务才以柠檬酸为主，如果 PH 超过 3 容易长生草酸，PH5.0 容易形成葡糖酸。通过对 PH 的控制精确，可以得到高产量的柠檬酸。金属离子：EMP 途径中的磷酸果糖激酶（PFK）是一个调节酶，它显示典型的真核生物 PFK 的共同调节性，是柠檬酸合成中的主要调
19、节点。 （锰缺乏降低了HMP 途径和三羧酸循环酶的活性，也导致了细胞内 NH4+水平升高，这种高浓度 NH4+是 PFK的一种调节因子，已经正式前述柠檬酸根对 PFK 的抑制。 ）3、为什么要变温培养？黑曲霉属于嗜温微生物，最适生长温度为 33-37积累柠檬酸的最适温度多数报道为 32产酸期如果仍维持高于 32 ，虽然开始柠檬酸生成较快，但长菌也较快，导致菌体量增加，大量的糖被用来生成菌体和呼吸，氧化成 CO和水只从柠檬酸产率的角度考虑，产酸期的温度应维持在 26 左右，这样可提高产酸率 10-20%，但发酵期延长约 2-3 天4、柠檬酸发酵是典型的好氧发酵过程，过程中对氧要求非常高？黑曲霉中
20、除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链，通过侧链呼吸不产生 ATP，不会抑制磷酸果糖激酶。在生产中发现，只要通气中断很短时间，会导致侧系呼吸链的不可逆失活，使得黑曲霉只能利用标准呼吸链 ，NADH 通过标准呼吸链氧化产生 ATP，会抑制磷酸果糖激酶。因此缺氧，甚至是暂时的缺氧即会导致柠檬酸产率的急剧下降，而对菌体生长并无负的影响。因此发酵中必须维持高浓度溶氧。5、如何筛选利用淀粉质原料的高产柠檬酸菌株。 （1）产酸指示剂法（2）透明圈法（3）对二甲氨基苯醛法第十讲丁二酸生产1、如何从瘤胃中筛选高产丁二酸的生产菌株瘤胃菌群-富集培养（丁二酸二钠莫能菌素 富马酸二钠）- 平板初筛（溴百里香
21、酚蓝）-复筛-菌株 A3 +50g/L 葡萄糖 -丁二酸2、 增强 CO2 供给和减少有机酸的抑制作用是丁二酸发酵过程中两个关键的问题。增加 增加 CO2 气体分压，d CO2 及CT 增加，CO 2 固定速率、丁二酸产率、SA/Ac 随之增加当有机酸浓度达到 23.4g/L 时，菌体的生长速率降为 0.进而以0.024h-1 的比衰亡速率死亡。未解离的有机酸分子透过细胞膜进入胞内影响细胞质内的 pH 环境，从而影响菌体代谢3、有机酸生产中厌氧与好氧方式的异同？同：都是微生物作用下的有机物降解过程，需要微生物培养的条件包括营养元素的合理分配、温度、pH 等异：产物不同环境不同（氧化还原电位、p
22、H、溶解氧等） ，动力能耗不同、产泥不同，关键是菌种不同4、丁二酸的生产过程是典型的厌氧过程，产品收率高。试从厌氧发酵的机理上解释其收率较好氧发酵为高的原理？（1）厌氧工艺是能量净生产者，需要的能量少（2）需要的营养物质少（3）容积负荷较高，需要的反应器容积小（4）无需通气管道，减少了不必要的损耗与污染第十一讲抗生素发酵1、抗生素的定义、合成方法及类型抗生素（Antibiotics）系指由细菌、真菌或其他微生物在生长过程中产生具有杀灭和抑制病原体的微生物产物，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。例如青霉素、链霉素、红霉素等。抗生素的生产方法：生物合成（微生物发酵） 、化学全合成、半合
23、成方法（将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团进行分子结构改造而制成各种衍生物。 ）2、发酵生产过程中温度的控制？pH 是如何调节的？the addition of acid(sulphuric) or base(ammonia or caustic). 加葡萄糖，降 ph，反之成立。3、什么是前体？青霉素的前体是什么，加入的目的，如何加入？前体：苯乙酸，苯乙酰胺，苯乙酰酯类、醇类等参与青霉素的生物合成，构成青霉素的分子结构；当成碳源和能源利用分解加入量不能大于 0.1%，采用多次加入方式第十二讲 PHA1、PHAs 的分类， PHAs 与传统塑料相比具有什么样的优点？PH
24、As：一类是短链 PHA（单体为 C3-C5） ，一类是中长链PHA(单体为 C6-C14)PHA 与传统塑料相比的优点：（1）良好的生物相容性（2）可完全生降解（3）良好的气体阻隔性（4）分子结构多样性，综合性能好（5）吴毒性2、PHAs 的发酵是典型的两步发酵，且需要给予特殊的发酵条件才可大量积累。试从 PHAs 的产生机理上给予说明？典型的两阶段发酵：具体的生长与产物的积累是一对矛盾，但又是矛盾的统一体。细菌的生长会提高产量，但同时也会消耗营养，以及对PH、DO、 OD、DCW、WCW等物性的控制，应用补料分批发酵的方式进行发酵，只有这样才能让产物大量积累第十三讲 酶的生产与生物转化1、
25、酶的类型（1）需要加入诱导物才可以产生的酶叫诱导酶（2）不需要加入诱导物就可以产生的酶叫组成型酶2、生物转化与传统合成相比的优势？（1）生物转化在温和的条件下进行，化学物质转变成要求的产品，不产出分解，而节约能源和投资（2）生物转化作用用于基质分子的专一位置，产生立体专一性，光学专一性产物，不需要化学拆分（3）顺序进行几步连续反映，大提高反应效率3、L-天冬氨酸转氨酶与 D-海因酶、D-N-氨甲酰基氨基酸水解酶的异同？同：都是手性分子，具有生物转化作用异：酶具有专一性所以转化对象不同4、使用胞内酶进行转化加入表面活性剂的作用？使用表面活性剂是为了降低细胞的表面张力，提高细胞通透性，从而减少酶活力的破坏程度和减小传质阻力，是细胞固定化更加容易
