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类型流式细胞术鉴定超微量免疫细胞样本.ppt

  • 上传人:yjrm16270
  • 文档编号:7877221
  • 上传时间:2019-05-28
  • 格式:PPT
  • 页数:14
  • 大小:4.18MB
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    流式细胞术鉴定超微量免疫细胞样本.ppt
    资源描述:

    1、使用CD115来鉴定和分析 小鼠血中单核细胞,12月2日,血中的单核细胞,白血球细胞 (leucocyte):粒细胞和非粒细胞 粒细胞(多形核白细胞): 中性粒细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞 非粒细胞 (单核白细胞):淋巴细胞,单核细胞和巨噬细胞,背景介绍,G,Koenderman L et al. J Leukoc Biol 2000;68:58-64,背景介绍,纵向小鼠模型(非致死):重要性:可用于预测疾病风险的增加,纵向评估病情的进展 需求:观察小鼠模型个体在外界刺激或者药物反应中的长期变化 困难:每次可采集的小鼠血液样本体积非常小小鼠单核细胞标记(占血液中细胞总数3%)CD11b:

    2、表达在多种细胞表面 (髓样细胞,NK细胞, 活化的T细胞,B细胞 ) CD14: 表面表达量低或检测不到,常用,-由此,需要建立有效的实验方案建立小鼠纵向模型,需要一种流式细胞仪, 可检测超微量血液样品同时又需保证重复性,数据准确更加可行的单核细胞标记,用于FACS: CD115- 细胞表面标记本身具有稳定性, 在检测微量血液样品体积时,测试结果具有一致性,提出的问题及实验的设计,VS,小鼠血样的采集 CD-1 雄性小鼠, 大隐静脉取血(每次采样0.5%体重,非致死方式),材料与方法,实验 1: 比较常用的小鼠单核细胞表面标记 (Guava easyCyte Mini)实验 2: 鉴定不同单核

    3、细胞表面标记的稳定性 A: 维持的时间长度 B: 不同的激光强度 (Guava EasyCyte Mini20mW; Guava easyCyte 6HT-2L40mW) C: 不同的抗凝剂实验 3: 确定可用于检测的最小血样体积(40ul、20ul、10ul、5ul),结果 1,比较小鼠单核细胞的表面标记(CD115 vs CD11b,CD14),95% CD115阳性细胞: 共表达CD11b+ 85% CD115阳性细胞: 共表达CD14+,如以CD115选取细胞群CD11b及CD14阳性率 差异小,50% CD11b阳性细胞:共表达 CD115 70% CD14阳性细胞: 共表达 CD1

    4、15,如以CD14与CD11b选取细胞群CD115阳性率 差异大,结果 1,比较小鼠单核细胞的表面标记(CD11b,CD14 vs CD115),95% CD115+: CD11b+ 85% CD115+: CD14,使用CD115+ 设门选取细胞群观察 CD11b与CD14,CD115所选取的细胞群亦表现 在CD11b及CD14阳性区域,结果 1,比较小鼠单核细胞的表面标记(CD115 与 CD11b,CD14),鉴定单核细胞表面标记CD115的稳定性 -A:维持的时间长度,0hr 2hr 4hr,CD115:33% 降低,CD11b:6.5% 降低,结果 2,easyCyte Mini:

    5、20mW,easyCyte 6HT-2L: 40mW,更强的激光强度,更高的 gMFI 但信号的降低程度一致 (33%),结果 2,鉴定单核细胞表面标记CD115的稳定性 -B:不同的激光强度,EDTA 4-8度(RT)更加稳定,结果 2,鉴定单核细胞表面标记CD115的稳定性 -B:不同的抗凝剂,确定可用于检测的最小血样体积,单核细胞总量: CD115+ 经典单核细胞: CD115+ Gr-1high 非经典单核细胞: CD115+ Gr-1low,8000 6000 3500 2000,40,20,10ul: 差异性 10% 5ul: 每次取样,单核细胞分亚型检测时差异大,因此,10ul 不推荐! 用于分析单核细胞的亚型,结果 3,结论,细胞表面标记:选择CD115抗体鉴定 本身虽具有不稳定性,但相比传统的表面标记选取单核细胞群更加准确 (时间控制, EDTA+冰上, 强的激光强度)实验对象:小鼠纵向(非致死)模型 确保了非致死取血的可能性 据此建立小鼠模型可检测个体变化 (=0.5% 的小鼠体重:可两周取一次, =0.05% 的小鼠体重:每天取)检测平台:高性能超微量检测的流式细胞仪 具有更高的激光强度: 在使用低表达的表面标记时,具有更好的灵敏度 使用超微量的样品: 实现建立小鼠纵向模型(非致死取血模型)的可能性,欢迎提问,谢谢!,

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