1、两种乳酸菌产酸培养基筛选及产酸分析崔卫东 龙 涛 王 炜 侯新强 杨 蓉 张 涛新疆农业 科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091关键词：乳酸菌 高效液相色谱新疆威仕达生物工程股份有限公司研制的“高效青贮复合菌” 是由 2 株乳酸菌、 1 株纤维素分解菌和 1株乙酸产生菌复合而成的，利用这 几株菌的协同作用，可 调节青贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，促进乳酸菌大量繁殖，更快地产生乳酸，促进多糖与粗纤维的转化，提高青贮饲料的质量。本文研究了其中的2 株乳酸菌在发酵条件下产生乳酸的情况，初步确定了 这 2 株乳酸菌的 产酸培养基，并采用 层析法进行了定性分析，采用高效液相色谱法进行了定量
2、分析。1 试验材料1.1 菌株乳酸链球菌（Streptococcus lactis），SL植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），LP均由新疆农业科学院微生物应用研究所提供。1.2 培养基1.2.1 碳源培养基筛选C1：C2：C3：葡萄糖 3%，玉米浆 5%，酵母膏 0.5%，Tween80 0.1%，CaCO3 2%，KH2PO4 0.1%，pH5.56.0蔗糖 2%，其余同 C1淀粉 2%，其余同 C1按上述配比配制培养基，每瓶 200ml（500ml 三角瓶）， 90KPa、105灭菌 30min。1.2.2 氮源筛选N1N1-0N2N2-0蔗糖 2%（碳源筛选中确
3、定），玉米浆 5%（氮源），酵母膏 0.5%，KH2PO4 0.1%，Tween80 水溶液（50mg/ml）0.5%，CaCO3 2%不添加 CaCO3，pH5.56.0，其余同 N1蔗糖 2%，蛋白胨 0.5%（氮源），其余同 N1不添加 CaCO3，pH5.56.0，其余同 N2按上述配比配制培养基，每瓶 200ml（500ml 三角瓶）， 90KPa、105灭菌 30min。1.3 仪器设备 分光光度计：Shimadzu UV-120-02数显 pH 计：Mettler Toledo 320真空浓缩旋转蒸发仪：Buchi V-80 自动指示旋光仪：WZZ-1 高效液相色谱仪：安捷伦 1
4、100 高速离心机；显微镜；旋转式摇床；恒温培养箱；电子天平；灭菌锅；净化工作台。1.4 玻璃器皿灭菌的 90mm 平皿、1ml 吸管、 500ml 锥形瓶、18 180 试管、移液管等。2 试验方法2.1 培养基筛选2.1.1 碳源筛选 SL、LP 菌 株 经 二 次 斜 面 活 化 ，制 菌 悬 液 ，等 量 接 种 C1、C2 和 C3 培 养 基 各 1 瓶 ，分 别于 37（SL）和 30（LP）静置培养。于 9hr、12hr、18hr、35hr 取样，测 pH、30 倍稀释液 540nm 的 OD 值、苯酚-硫酸法 1测发 酵液中残糖量，根据发酵液 pH 变化，菌体生长速率，糖消耗
5、率确定利用率高、 产酸量大的碳源作为产酸培养基的碳源。注：制备发酵液 30 倍稀释液时， （1）含 CaCO3 的发酵液取样 0.5ml，加 1mL2N HCl 溶液，再加 13.5ml 蒸馏水，即得。 （2）不含 CaCO3 的发酵液取样 0.5ml，直接加 14.5ml 蒸馏水，即得。2.1.2 氮源筛选 SL、LP 菌株经二次斜面活化，制菌悬液，等量接种，分别于 37 和 30 静置培养。于14hr、22hr、40hr 取样，测 N1 和 N2 的 30 倍稀释液 540nm 的 OD 值 ，N1-0 和 N2-0 的 pH、30 倍稀释液540nm 的 OD 值，根据发酵液 pH 变化
6、，菌体生长速率，确定利用率高、产酸量大的氮源作为产酸培养基的氮源。2.1.3 确定产酸培养基及培养条件 根据 2.1.1 和 2.1.2 的结果，确定 这两株菌的产酸培养基和培养条件，制备发酵液。2.2 乳酸定性分析2.2.1 样品制备 2 发酵液中加入 5%碳酸钙，搅拌后， 缓缓加入硫酸至 pH2.0，高速离心机 5000rpm 离心10 分钟，取上清，经真空旋转蒸发浓缩到原体积的 1/10 即得。2.2.2 纸层析法测乳酸 3 以 2%乳酸为对照(CK)，与样品平行点样，层析。2.3 液相色谱法定量测定乳酸2.3.1 样品制备 发酵液经高速离心机 3000rpm 离心 10min，取上清
7、5ml，加入 0.2mol/l 磷酸进行酸化，用水定容至 10ml，0.3um 膜过滤，上机测定。2.3.2 色谱条件 色谱柱：C18 柱 10m0.5m4.6mm30mm;流动相：0.01moL/l 磷酸氢二铵（用 1moL 磷酸调 pH 至 2.70，临用前用超声波脱气） ;流速：1ml/min; 进样量：20l;紫外检测波长：214nm3 结果与分析3.1 产酸培养基筛选3.1.1 碳源筛选（1）不同碳源培养基乳酸菌 OD、pH 比较样品 9hr 12hr 18hr 35hr菌株 培养基 OD pH OD pH OD pH OD pHC1 0.047 4.42 0.090 4.07 0.
8、037 3.86 0.089 3.72C2 0.162 4.21 0.293 3.87 0.246 3.20 0.398 3.06SLC3 0.152 4.44 0.239 3.89 0.245 3.91 0.339 3.92C1 0.066 4.35 0.120 3.86 0.137 3.53 0.278 3.29C2 0.194 4.27 0.225 3.62 0.348 3.32 0.413 3.01LPC3 0.164 5.02 0.212 4.81 0.261 4.78 0.351 4.83（2）苯酚-硫酸法测残糖量葡萄糖标准曲线：0 0.005 0.010 0.015 0.020
9、0.025X(mg/mL)Y(OD490) 0.035 0.206 0.406 0.581 0.735 0.920计算：一元回归方程为 Y=0.0377 +35.66X相关系数 r=0.9996不同碳源培养基乳酸菌残糖比较12 hr 18 hr 35 hr菌株 培养基 OD490 残糖量 mg/mL OD490 残糖量 mg/mL OD490 残糖量 mg/mLSL C1 0.240 0.00570.174 0.00380.303 0.00740.304 0.00750.166 0.00360.227 0.00530.118 0.00230.242 0.00570.143 0.00300.10
10、3 0.00180.057 0.000540.048 0.000290.064 0.000740.067 0.000820.044 0.00018C2C3C1LPC2结果表明：这两种菌在 C2 培养基中生 长、 产酸以及碳源利用率都优 于另外两种培养基，所以将蔗糖确定为产酸培养基的碳源。3.1.2 氮源筛选 不同氮源培养基乳酸菌 OD、pH 变化比较14hr 22hr 40hr菌株 培养基OD pH OD pH OD pHSL N1N1-0N2N2-00.0500.095 3.870.0750.139 3.440.1020.151 3.900.1230.162 3.450.0510.193 3
11、.840.0660.219 3.42LP N1N1-0N2N2-00.1350.163 3.550.1400.185 2.900.2580.362 3.390.3640.462 2.760.1370.182 3.190.1440.230 2.61结果表明：这两种菌在 N2 和 N2-0 培养基中生长、产酸都优于其他的培养基中，所以将蛋白胨确定为产酸培养基的氮源。3.1.3 产 酸培养基及培养条件 从碳源、氮源的筛选确定产酸培养基如下：蔗糖 3%，蛋白胨 0.5%，酵母膏0.5%，KH2PO4 0.1%，Tween80 水溶液 0.5%，CaCO3 2%。培养条件：SL、LP 分别于 37和 3
12、0条件下静置 24hr。3.2 定性测定乳酸纸层析法测乳酸喷显色剂后显色如右下图：RfCK = 19/25 = 0.76RfSL = 18.8/25 = 0.752RfLP = 18.9/25 = 0.756分析：喷显色剂后 SL 和 LP 都出现黄色斑点，与 2%乳酸对照相比，位置基本相同， 证明有乳酸的存在，表明两种菌都产乳酸。3.3 高效液相色谱定量测定乳酸SL 菌发酵产乳酸 11.6g/L；LP 菌发酵产乳酸 16.3g/L参考文献1 Maynard A. Joslyn(1970), Methods in Food Analysis, Physical, Chemical and Instrumental Methods of Analysis, 180-186；2 王博彦主编，发酵有机酸生 产与应用手册，中国轻工业出版社，2000.9：352；3 中国科学院微生物研究所细菌分类组；一般细菌常用鉴定方法；科学出版社，1978.11：179。作者简介 崔卫东，男，35 岁，新疆 农业 科学院微生物应用研究所，研究室主任，副研究员，生物工程、发酵工程领域， 电话：0991-4530178；传真：0991-4534351， Email：CK SL LP19cm 18.8cm 18.9cm展开剂前沿25cm点样线
