1、斜面低温保藏法&液体石蜡保藏法 &沙土保藏法 1.斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 24 个月，移种一次。酵母菌 2 个月，细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，致使微生物的代谢改变，而影响了微生物的性状，并且需要屡次传代，基菌种是经常使用，而条件不变，可应用此法。2.液体石蜡保藏法(1）先将液体石蜡（亦称石蜡油）装入三角瓶中，装量不超
2、过三角瓶总体积的 1/3，塞上棉塞，报纸包扎后，进行高压灭菌(121，30min)，连续灭菌 2 次，然后放在室温或 40温箱中 1 周，使水气蒸发掉，石蜡油变为透明状备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。(3）用灭菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面上，其用量高出斜面顶端 lcm 为准，使菌种与空气隔绝(4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。液体石蜡可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌种死亡，另一方面液体石蜡可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，从而延长了菌种保藏的时间此法实用而效果很好。霉菌、放线
3、菌、芽孢菌可保藏 2 年以上不死，酵母菌可保藏 12 年，一般无芽孢细菌也可保存 1 年左右。此法的优点是制作简单，不需特株设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。3沙土保藏法(1）取河沙加入 10稀盐酸，加热煮沸 30min, 以去除其中的有机质。(2) 倒去酸水，用自来水冲洗至中性(3) 烘干，用 40 目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。(4）另取非耕作层的瘦黄土或红土（不合腐殖质）。加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。(5) 烘干，碾碎，通过 100 目筛子过筛，以去除粗颗粒。(6) 按一份黄土、三份沙的比例掺和均匀，装入小试管(l 0m Ll00mm )
4、，每管装 1g 左右，塞上棉塞，进行灭菌、烘干。(7）抽祥进行无菌检查，每十支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中， 37培养 48h,若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再做无菌试验，若证明无菌，即可备用。(8) 选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。(9) 于每沙土管中加入约 0.5mL（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。(10）放入真空干燥器内，抽真空，必须在 12h 小时以内抽干水分。(11) 每 10 支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚需进一步抽样检查。(12) 检查如没有问题，则存放冰箱成室内干操处。每半年检查一次活力和杂菌情况。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗菌素工业生产中应用最广、效果亦好可保存 2 年左右。但应用于营养效果不不佳。
