1、5 血型检测5.1 红细胞血型检测5.1.1 红细胞血型血清学检测技术规范5.1.1.1 对标本的一般要求5.1.1.1.1 实验室所检测标本须有清晰的惟一性标识。5.1.1.1.2 标本须和血液、血液成分制品来自于同一献血者。5.1.1.1.3 所检测的标本可为抗凝的或不抗凝的标本。抗凝剂推荐使用乙二胺四乙酸（EDTA）。5.1.1.1.4 须遵守试剂/仪器使用说明书中所限定的标本制备和保存步骤；当说明书内容不能涵盖相关要求时，可用经确认的标本制备和保存步骤。5.1.1.1.5 肉眼判定标本是否存在影响检测结果的因素,如溶血、脂血等。5.1.1.2 仪器设备的要求5.1.1.2.1 仪器设备
2、在安装后，需校准方可使用，校准周期至少一年一次，仪器设备需有维护程序。所有的校准、维护须有记录。5.1.1.2.2 仪器设备所使用的软件和实验室的信息系统须经过确认。5.1.1.3 记录的要求5.1.1.3.1 所有检测标本具有可追溯性。5.1.1.3.2 核对当前 ABO/RhD 定型结果与既往的血型记录是否一致，结果不一致必须查找原因。5.1.1.4 ABO/RhD 定型5.1.1.4.1 原理5.1.1.4.1.1 根据红细胞上和血清（或血浆）中有或无 A 抗原或/和 B 抗原及其抗体，将血型分为 A 型、B 型、AB 型及 O 型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定 AB
3、O 血型。正定型是用已知抗-A 或抗-B 定型试剂来测定红细胞上有无相应的 A 抗原或/和 B 抗原；反定型是用已知 A 型细胞和 B 型细胞来测定血清中有无相应的抗-A 或/和抗-B。5.1.1.4.1.2 利用红细胞凝集试验，通过抗-D 定型试剂，测定红细胞上是否存在 RhD 抗原。红细胞上有 RhD 抗原称 RhD 阳性，无 RhD 抗原为 RhD 阴性。5.1.1.4.2 试剂与材料5.1.1.4.2.1 所有用于检测与确认的 ABO 血型定型试剂都必须符合国家相关规定。5.1.1.4.2.2 按照试剂使用说明书的要求配制红细胞悬液。如果说明书中无具体要求，建议的红细胞悬液浓度为：试管
4、法、微量板法 2-5，微柱凝胶法 0.8-1。5.1.1.4.3 技术要求5.1.1.4.3.1 需用抗-A 和抗-B 试剂测定红细胞；用 A1和 B 红细胞测定血浆或血清，进行ABO 定型。正反定型结果不一致或有疑问，需进一步进行 ABO 血型确认试验(见 5.2.2)。5.1.1.4.3.2 需用抗-D 试剂测定 RhD 血型；红细胞在直接凝集试验中被 IgM 抗-D 凝集的和在 RhD 阴性确认试验中被任何一种抗-D 凝集的都应标记为 Rh 阳性。在直接凝集试验和在 RhD 阴性确认试验中与任何一种抗-D 都不凝集的血液需标记为 RhD 阴性。红细胞与 IgM抗-D 定型试剂在直接凝集试
5、验中不凝集的标本，需进一步进行 Rh 阴性确认试验(见 5.2.4)。5.1.1.4.3.3 试管法、微量板法、微柱凝胶法都适用于标本的 ABO/RhD 定型。5.1.1.4.4 注意事项5.1.1.4.4.1 ABO/RhD 定型试验需在适应的实验温度中进行。一般实验温度应保持在 18-25 。5.1.1.4.4.2 确认 ABO/RhD 血型所用的试剂与检测定型的试剂须来自不同的细胞株。5.1.1.4.4.3 ABO/RhD 血型的鉴定可用经验证有效的基因诊断的方法，通过鉴定相关血型基因来完成 ABO/RhD 基因定型。5.1.1.4.5 ABO/RhD 定型质控5.1.1.4.5.1 检
6、测标本时必须设立阳性和阴性对照试验：对照试验的频次取决于工作模式、使用的方法和试剂的使用说明。表 5.1.1.1 AB0/RhD 定型试验阳性对照、阴性对照所选用的细胞试剂 阳性对照 阴性对照抗-A A 细胞 B 细胞抗-B B 细胞 A 细胞抗-D RhD-阳性细胞 RhD-阴性细胞A1分型细胞 抗-A 抗-BB 分型细胞 抗-B 抗-A5.1.1.4.5.2 每一批抗-A，抗-B，都必须与 A1，B 和 O 细胞有合适的反应能力。每一批试剂反定型红细胞都必须与抗-A，抗-B 有合适的反应能力。5.1.1.4.5.3 每批抗-D 定型试剂都必须与 R1r 有合适的阳性反应能力，同时与 rr
7、或 rr细胞不凝集。5.1.1.5 不规则抗体筛选5.1.1.5.1 原理用已知抗原表型的试剂红细胞组，通过直接凝集试验和间接抗球蛋白试验，筛选标本中可能存在的血型同种免疫性抗体。避免含有临床意义的血型同种抗体随血液、血液成分制品一同输入。5.1.1.5.2 试剂与材料用于筛选的试剂红细胞必须来自至少两名无关 O 型供者，要求一种细胞为 R1R1，另一种为 R2R2表型，且表达下列抗原：M，N，S，s，Mur，Di a，k，Fy a，Fy b，Jk a，Jk b 和 Lea。并尽可能多的包含 Duffy, Kidd 血型系统中主要抗原的纯合子以及低频率抗原。不可通过混合来自不同供者的细胞获得需
8、要的抗原表达范围。5.1.1.5.3 方法用于标本抗体筛选实验的技术包括：经典的血型血清学盐水悬浮细胞凝集试验、间接抗球蛋白试验以及各种改良的间接抗球蛋白试验；非经典的抗原抗体检测技术包括免疫荧光技术、放射免疫技术、酶联免疫吸附试验（ELISA） 、固相红细胞粘附试验以及凝胶试验。不同方法的可靠性存在差异，应根据要求选择相应方法。5.1.1.5.3.1 盐水悬浮细胞凝集试验:在试管或微量板中将血浆(血清)与筛选细胞 1:1 混合。室温立即离心和/或 37孵育 30 分钟后离心判读结果。5.1.1.5.3.2 间接抗球蛋白试验:在试管或微量板中将血浆(血清)与筛选细胞 1:1 混合, 37孵育
9、30 分钟后，弃去上清，用生理盐水洗涤三次红细胞。加抗人球蛋白试剂，离心判读结果。5.1.1.5.3.3 必须对筛选检测出的抗体进行鉴定，评估其临床意义。不进行抗体鉴定的实验室需将抗体筛选阳性标本送至具有资质的参比实验室进行最后鉴定或确证。5.1.1.5.4 注意事项5.1.1.5.4.1 有些抗体(如-Le a,-Jka)在盐水悬浮细胞凝集试验中可溶解抗原不配合的红细胞。5.1.1.5.4.2 在进行间接抗球蛋白试验时，必须有 IgG 致敏的红细胞作为阳性对照。同时需定期使用含临床意义的弱抗体附加对照试剂 (如抗 Fya或抗-Jk a) 以确保试验步骤的敏感性和试剂红细胞抗原表达的完整性。5
10、.1.1.5.4.3 其它方法如果已经验证和证明其适用性，可作为间接抗球蛋白试验的补充 (而非替代)，如酶处理技术或聚凝胺方法。但对某些临床重要性抗体，间接抗球蛋白试验优先于其它可选择技术。5.1.1.5.4.4 注意血清与红细胞的比率，特别是使用 Liss 和 PEG 等促凝剂时，适当增加血清比例，防止弱抗体的漏检。5.1.1.5.4.5 抗体筛选应能检出浓度不高于 0.5 IU/mL 的抗-D。5.1.1.6 附加实验5.1.1.6.1 实验室可根据临床的需求，对标本开展稀有血型的筛选。5.1.1.6.2 实验室可根据临床的要求，对标本开展 HLA 和粒细胞抗体的筛选。5.1.1.7 质量
11、控制5.1.1.7.1 检测过程中必须开展室内质量控制，检测当天至少做 1 次室内质量控制。5.1.1.7.2 推荐使用具有弱抗体或具有弱阳性直接抗球蛋白试验（DAT）结果的红细胞作为质控品，来评价实验室是否能检出弱凝集。5.1.1.7.3 实验室必须至少参加一项由加国家有关部门认可或得到认证的机构组织的室间质量评价活动。5.1.2 红细胞血型血清学检测操作规程5.1.2.1 ABO 定型5.1.2.1.1 原理根据红细胞上有无 A 抗原或(和)B 抗原，将血型分为 A 型、B 型、AB 型和 O 型四种，可利用红细胞凝集试验通过正(血清试验)反(细胞试验)定型准确鉴定 ABO 血型。ABO
12、血型的鉴定必须用已知抗-A 和抗-B 分型血清来测定红细胞上有无相应的 A 抗原、B 抗原，用已知混合的 A 型红细胞和 B 型红细胞检测血清中有无相应的抗-A、抗-B，这两种试验可以作为相互验证的质量控制方法。5.1.2.1.2 试剂与材料抗-A 和抗-B 定型试剂；抗-AB 定型血清； A、B 及 O 型试剂红细胞；受检者血清；受检者红细胞盐水悬液或全血。5.1.2.1.3 方法和结果解释5.1.2.1.3.1 玻片试验测定红细胞 ABO 血型A. 在标记的玻片上分别加 1 滴抗-A、抗-B、抗-AB，各加 1 滴红细胞悬液(按试剂说明书的要求配置受检者红细胞浓度)；B. 用干净的加样棒将
13、红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖大约 20mm20mm 的面积； C. 缓慢连续倾斜转动玻片 2 分钟，观察结果并解释。不要把玻片放在加热的表面物上，以防水份蒸发。 D. 结果解释a. 凝集为阳性结果；b. 细胞均匀悬液 2 分钟后为阴性结果；c. 对结果有怀疑，应用试管法重新实验。E. 注意事项a. 玻片试验不适用于患者和献血者血清中的 ABO 抗体测定。b. 不要混淆干燥的边缘与凝集。5.1.2.1.3.2 试管试验测定红细胞及血清 ABO 血型A. 细胞定型 (正定型)a. 取洁净小试管 3 支，分别标明抗-A、抗-B 和抗-A+B，用滴管分别加 1 滴抗-A、抗-
14、B 和抗-A+B；b. 在每个试管中各加 1 滴 25%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，根据试剂使用说明书进行离心。通常的条件是离心 9001000g, 1530 秒；c. 轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果，与血清定型结果比较。B. 血清定型 (反定型)a. 取洁净小试管 2 支，分别标明 A1、B 细胞。用滴管分别加入受检者血清 1 滴 (注：根据需要可加 A2和 O 细胞)；b. 在标记 A1的试管中加 1 滴 A1试剂红细胞；在标记 B 的试管中加 1 滴 B 试剂红细胞；如需要可加 A2和 O 细胞；轻轻混匀试管，根据试剂使用说明书进行离心。通常的条件是9001000g, 1530 秒
15、；c. 检查上清液有无溶血，轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果，与细胞定型结果比较。 C. 结果解释a. 细胞定型试验的凝集及血清试验的溶血或凝集都表示阳性结果；b. 重悬细胞扣后的均匀的红细胞悬液表示阴性结果；ABO 细胞及血清试验的结果和解释见表 5.1.2.1；c. 若正反定型结果不符，应进一步试验以确定血型。5.1.2.1.3.3 微量板试验定红细胞及血清的 ABO 血型微量板可以是 U 型或 V 型底，硬质塑料或软质塑料，96 孔板或 120 孔板，可通过离心微量板或是将板放置一定角度观察结果。A. 细胞定型 (正定型)a. 在微量板的两个干净孔内分别加入 1 滴抗-A、抗-B， （
16、如需要，可在第三孔内加 1滴抗-AB 试剂） ；b. 在含有血型定型试剂的各孔内加 1 滴 2%红细胞悬液；轻叩板边，混匀孔内物质；c. 离心 200g，3060 秒；用手轻叩板或借助振荡器重悬细胞扣；判读结果，比较血清试验的结果。 B. 血清定型 (反定型)a. 在微量板的两个干净孔内，每孔内加 1 滴受检者血清或血浆；b. 在含有血清或血浆的各孔内分别加 1 滴 2%A1和 B 细胞(如需要，可在第三、四孔内各加 1 滴 A2或 O 细胞)；轻叩板边，混匀孔内物质；c. 离心 200g，3060 秒；用手轻叩板或借助振荡器重悬细胞扣；判读结果，比较细胞试验的结果。C. 结果判读与解释a.
17、细胞定型试验的凝集及血清试验的溶血或凝集都表示阳性结果；b. 重悬细胞扣后，均匀的红细胞悬液表示阴性结果；ABO 细胞及血清试验的结果和解释见表 5.1.2.1；c. 若正反定型结果不符，应进一步试验以确定血型。表 5.1.2.1 ABO 血型正、反定型试验结果受检者红细胞与定型血清的凝集反应受检者血清与试剂红细胞的凝集反应结果判读抗-A 抗-B A 细胞 B 细胞 O 细胞 ABO 血型- - + + - O+ - - + - A- + + - - B+ + - - - AB注：+:凝集，-:不凝集D. 注意事项O 型红细胞在 ABO 反定型试验中作为一个对照细胞可检出抗 H(如孟买型)、缗
18、钱状凝集以及检查血清中存在的与血型抗原抗体无关却能使细胞发生凝集的某些物质。5.1.2.2 ABO 亚型鉴定ABO 抗原的亚型或变异型很多，在 A 抗原中主要为 A1和 A2，其它 A 亚型不多见，而 B亚型一般比 A 亚型更少，区分 ABO 亚型，可根据：红细胞与抗-A、抗-A 1、抗-B 及抗-AB 的凝集程度；红细胞上的 H 物质活性的强弱；血清中是否存在抗-A 1和不规则抗-B；分泌型人唾液中 A、B、H 物质。5.1.2.2.1 A1和 A2亚型鉴定5.1.2.2.1.1 原理抗-A 血清中含有抗-A 和抗-A 1两种抗体，抗-A 可以凝集 A 型和 AB 型红细胞，而抗-A 1只能
19、与部分 A 型和 AB 型红细胞反应，据此凡与抗-A 1强反应者被定为 A1或 A1B 型，不与抗-A1反应，而与抗-A 强反应者被定为 A2或 A2B 型。5.1.2.2.1.2 试剂与材料抗-A 1定型血清；受检者 25%的红细胞悬液；已知 A1和 A2型 25%红细胞盐水悬液。5.1.2.2.1.3 方法A. 在 1 支标记的干净试管中加 1 滴抗-A；在另 1 支标记的干净试管中加 1 滴抗-A1；B. 在每个试管中分别加入 1 滴 25%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，根据厂商的试剂使用说书明进行离心。通常的条件是室温、9001000g 离心, 1530 秒；同时，用已知的 A1 和
20、A2 试剂红细胞作为对照，进行平行对照试验；C. 轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果。5.1.2.2.1.4 结果判读如 A1对照红细胞凝集，而 A2对照红细胞不凝集，受检者红细胞凝集者为 A1，不凝集者为 A2。5.1.2.2.1.5 注意事项A. 检查时必须掌握反应时间；B. 如 A1和 A2对照红细胞都凝集，表示抗-A 1血清有异常；如 A1和 A2对照红细胞都不凝集，可再延长观察时间，如始终不凝集，也证明抗-A 1血清有异常。C. 新生儿红细胞 ABO 血型抗原较弱，不宜作亚型鉴定。5.1.2.2.2 用吸收和放散法鉴定其他弱 A 或弱 B 亚型5.1.2.2.2.1 原理有弱 A 或
21、弱 B 抗原的红细胞不被抗-A 或抗-B 所凝集，但可以吸收这种特异性抗体。用放散法除去吸收的抗体就能证实与已知特异性抗体反应的抗原活性物质的存在。5.1.2.2.2.2 试剂与材料人血清(多克隆)抗-A 或/和抗-B（注：因为一些单克隆 ABO 定型试剂，对 pH 及渗透压的变化敏感，所以不适用吸收、放散试验） ；放散试剂：（见 5.1.2.7 放散试验)；受检者红细胞。5.1.2.2.2.3 方法A. 用盐水至少洗涤 1ml 受检细胞 3 次，最后一次洗涤后移除上清液；B. 在洗涤过的红细胞中加入 1ml 抗-A 试剂(鉴定弱 A 变异型)或 1ml 抗-B 试剂(鉴定弱B 变异型)；C.
22、 充分混均红细胞和抗血清，把混合物置 4中 1 小时；离心混合物，移除上层抗血清；将红细胞转入一个干净试管；D. 用大量 4冷盐水(1ml 或更多)至少洗涤红细胞 6 次，留下最后 1 次洗涤的小部分洗涤液作游离抗体检测。或者用 O 型细胞作为对照细胞与被检细胞平行做吸收放散试验；E. 使用适合于将 ABO 抗体从红细胞上解离下来的放散方法，如热放散，从细胞上放散出吸收的抗体（见 5.1.2.7 放散试验)） ；F. 离心，将上层放散液转入 1 个干净试管；G. 检测放散液及最后洗涤液(上述第 D 步)：所有放散液及最后洗涤液加 1 滴相应细胞，离心后放置于 430 分钟后检查凝集状况。H.
23、37 度，孵育 15 分钟后，将步骤 G 中的样本进行间接抗人球蛋白试验。5.1.2.2.2.4 结果判读A. 如果放散液与抗原阳性细胞反应，最后洗涤液与抗原阳性细胞不起反应；或者 O 型对照红细胞平行试验放散液与抗原阳性细胞不起反应；则放散液中存在抗-A 或抗-B，细胞上存在 A 或 B 抗原。B. 如果放散液不与 A 或 B 细胞发生反应，可能表明细胞上没有抗原表达，不能吸收相关抗体，或是放散液制备失误造成。如果放散液与一些所有 A 或 B 细胞，也与一些或所有O 细胞起反应，表明在吸收放散过程中，重新获得了一些其他的或附加的抗体。C. 如果最后洗涤液或 O 型红细胞对照放散液与 A 或
24、B 细胞起反应，则认为试验是无效的。其原因可能是放散前未结合的抗体没有充分去除或是细胞没有充分洗涤，还可能是结合的抗体在洗涤过程中分离。5.1.2.2.3 A、B、H、Le(a)和 Le(b)唾液试验5.1.2.2.3.1 原理人群中约有 78的人含有 Se 基因，它能控制分泌可溶性 ABH 抗原物质，进入体液(脑积液除外)。抗体能与具有相应抗原的红细胞发生特异性凝集。体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生中和反应，抑制抗体凝集作为反应指示的红细胞。利用血凝抑制方法，把唾液中可溶性 A、B、H、Lewis 血型物质和相应的抗体中和，然后加入相应细胞。如果这些细胞凝集就表示唾液中不含有相应的可溶性
25、抗原；若不凝集，就表示唾液中含有相应的可溶性抗原，即为分泌型。5.1.2.2.3.2 唾液的留取A. 刷牙或漱口后，收集 510ml 唾液于小烧杯或大口试管中，咀嚼蜡、石蜡、橡皮条能帮助收集唾液，不能咀嚼口香糖或任何其它含糖或蛋白的东西；B. 离心 9001000g，810 分钟，将上清液移入干净试管，煮沸 810 分钟以灭活唾液酶；C. 离心 9001000g，810 分钟，取清亮或微呈乳白色的上清液，将不透明或半固体状的物质丢弃；D. 几小时内实验，标本须冷藏；几天内实验，样品须-20保存，冰冻保存的样品活性可持续几年。5.1.2.2.3.3 试剂与材料人源性(多克隆)抗-A 和抗-B（注
26、：单克隆试剂可能造成假抑制） ；抗 H：植物凝集素，可从金雀花种子的盐水浸出液中制备，也可用单克隆抗 H，但须事先证明该抗 H 可以和唾液中 H 物质反应；多克隆(兔、羊)抗 Le(a)；A1 型 B 型红细胞；O 型，Le(a+b-)红细胞；冰冻或新鲜的样品及用作阳性、阴性对照的分泌型，作分泌型者的唾液；经处理后的受检者唾液。5.1.2.2.3.4 方法A. 选择血型试剂的最佳稀释度：倍量稀释抗血清，在每一稀释度的 1 滴抗血清中加入1 滴相应 25%红细胞,离心，选择凝集强度为 2+的最高稀释度的抗血清；B. 在四只试管中加入 1 滴最佳稀释度的血型试剂，A、B、H 唾液实验分别标明：“分
27、泌型” ， “非分泌型” ， “盐水” ， “测定者” ；Lewis 唾液试验则标明“Lewis 阳性” ， “Lewis阴性” ， “盐水” ， “测定者” ；C. 在“分泌型” ， “非分泌型” ， “测定者”试管中，加入 1 滴相应的唾液， “盐水”管中加入 1 滴盐水,混匀置于室温 10 分钟；D. 在每支试管中加入相应的红细胞 1 滴,混匀置于室温 3060 分钟,离心,目测结果。5.1.2.2.3.5 结果判读A. 细胞与试管中的抗体发生凝集反应，表明该唾液不含有相应抗原；B. 细胞与已知抗体不发生凝集反应，表明唾液中含有相应的抗原；C. 细胞不与唾液对照管的抗体凝集，唾液试验结果
28、无效，通常是由于试剂的稀释度太大，应重新选择合适的稀释度做试验。5.1.2.2.3.6 注意事项A. 用已知分泌型和非分泌型人的唾液作为试验的对照。对于 ABH 物质测定，使用经检验为 Se 和 sese 人的唾液；对于 Lewis 试验，使用 Le(a+b-)或 Le(a-b+)表现型的人红细胞作为阳性对照。阴性对照是 Le(a-b-)的红细胞。试剂对照用盐水。B. 可以使用唾液的连续盐水稀释法来做血型活性物质的半定量测定，除去已知活性所需要的稀释度愈高，存在于唾液的血型物质就愈多。必要时要在与抗体孵育前稀释唾液。C. Lewis 阳性的人被证明是 A、B 和 H 分泌者，可以假定其唾液也含
29、有 Le(b)和 Le(a)物质，若 Le(a)阳性者是 ABH 非分泌型，缺乏 Se 基因，则在唾液中仅有 Le(a)。D. 如果唾液在加热前不先离心并除去沉淀，则可以从可能存在的细胞中释放 H 物质，使非分泌型导致假阳性。E. 欲从唾液中得到清晰的不含有粘液的液体，可先将唾液冰冻保存数天，融化后离心，除去细胞碎屑。F. 为了防止弱分泌型的漏检，可同时作盐水对照试验，比较二者凝集强度。5.1.2.3 Rh 血型鉴定5.1.2.3.1 原理Rh 血型系统目前共有 47 个抗原，其中最常见的主要有 C,c,D,E,e 5 种。可分别用抗C、抗 c、抗 D、抗 E、抗 e 这 5 种 Rh 定型试
30、剂通过血凝试验来检查红细胞上是否存在相应抗原。在临床输血中，一般只做 D 抗原的鉴定。凡被检红细胞和抗 D 试剂凝集者为 RhD 阳性，不凝集者为 RhD 阴性。其它 Rh 抗原鉴定和 D 抗原一样，只是加相应的定型试剂即可。根据所选试剂的恃性，RhD 血型的鉴定方法可采用试管直接盐水凝集法，酶技术、抗人球蛋白技术、聚凝胺、微柱凝胶等。5.1.2.3.2 试剂与材料RhD 定型试剂：包括多克隆高蛋白、化学修饰低蛋白或混合型 IgM/IgG，单克隆/多克隆低蛋白的试剂；RhD 对照试剂(制造商不同对照试剂也不同，可根据试剂的使用说明选择)；受检者红细胞悬液；已知 RhD 阳性和阴性红细胞各 1
31、份。5.1.2.3.3 方法5.1.2.3.3.1 玻片 RhD 抗原定型试验5.1.2.3.3.1.1 在一块标记的干净玻片上加 1 滴抗 D 定型试剂；5.1.2.3.3.1.2 在第二块标记的玻片上加 1 滴合适的对照试剂；5.1.2.3.3.1.3 在每块玻片上加 2 滴受检者 4050%红细胞悬液；5.1.2.3.3.1.4 用玻棒将细胞悬液试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片20mmx20mm 面积；5.1.2.3.3.1.5 把两块玻片同时放在观察箱上，缓慢连续倾斜转动并观察凝集。多数试剂要求试验必须在 2 分钟内判读结果，因为孵育会导致混合物的干涸，有可能被误认为是凝
32、集。5.1.2.3.3.1.6 解释和记录结果。5.1.2.3.3.1.7 结果解释A. 当含有抗 D 试剂的玻片上出现红细胞凝集而对照玻片上是均匀的红细胞悬液时为阳性结果；B. 当含有抗 D 试剂的玻片和对照玻片上都是均匀的细胞悬液时，提示是阴性结果，如果要进行 RhD 阴性确认试验，则必须采用其它的方法。C. 如对照玻片上出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；D. 玻片边沿附近的干涸不应该混淆为凝集。5.1.2.3.3.2 试管盐水直接凝集 RhD 抗原定型试验5.1.2.3.3.2.1 在 1 支标记的干净试管中加入 1 滴抗 D 定型试剂；在第 2 支标记的试管中加入 1
33、 滴合适的对照试剂；5.1.2.3.3.2.2 在每支试管中各加 1 滴 25%受检者的红细胞悬液；轻轻混合，离心；5.1.2.3.3.2.3 轻轻重新悬浮细胞扣，检查凝集。5.1.2.3.3.2.4 结果解释A. 当含有抗 D 试剂的试管出现 2+或 2+以上的凝集而对照管呈现均匀悬液，是阳性结果；B. 如含有抗 D 试剂的试管凝集低于 2+或 1+低于阳性对照，或对照管出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；C. 含有抗 D 试剂的试管和对照管都是均匀悬液者，提示可能是阴性的实验结果。被检红细胞可疑为 RhD 阴性。5.1.2.3.3.3 微量板 RhD 抗原定型试验以下介绍的
34、是通常的微量板鉴定 RhD 血型技术。可根据试剂使用说明书中的要求，使用特定的试剂与仪器。A. 在一个干净的微量板孔内加 1 滴抗 D 试剂，如试剂需要 RhD 对照，在第二个孔内加 1滴对照试剂；B. 在每一个孔内加 1 滴 2%5%的红细胞悬液，轻叩微量板边缘，混匀,离心 200g 3060 秒；C. 用手工或借助振荡器重悬细胞扣，判读，解释记录结果；D. 阴性结果孵育 371530 分钟,离心 200g 3060 秒,用手工或借助振荡器重悬细胞扣,判读，解释，记录结果。5.1.2.4 RhD 阴性确认试验5.1.2.4.1 原理由 D 抗原位点数减少或抗原结构产生变异所产生的一些弱 D
35、和不完全 D 红细胞，它们虽然有 RhD 抗原，但与常规使用的抗 D 定型试剂不凝集或弱凝集。确定这些红细胞上是否有 D 抗原存在需进一步采用含 IgG 抗 D 抗体的试剂进行抗球蛋白试验以提高试验灵敏度，达到检测弱 D 的目的，以及采用抗不同 D 表位的抗 D 抗体，测定 37 种 D 表位中的不同 D 表位，达到检测不完全 D 表型的目的。当确定红细胞上无 D 蛋白表达时，才能最终判定被检标本为 RhD 阴性。5.1.2.4.2 试剂与材料抗 D 定型试剂；IgM+IgG 抗 D；抗人球蛋白试剂，多特异性抗球蛋白或抗 IgG；IgG 致敏红细胞； 25%受检者的红细胞。5.1.2.4.3
36、方法5.1.2.4.3.1 在 1 支标记的干净试管中加入 1 滴 IgM 抗 D，在第 2 支试管中加入 1 滴合适的对照试剂；5.1.2.4.3.2 在 2 支试管中各加入 1 滴 25%受检者的红细胞悬液；5.1.2.4.3.3 混匀，并在 37孵育 1530 分钟(根据试剂说明书)；9001000g 离心1545 秒；5.1.2.4.3.4 轻轻重新悬浮细胞扣并观察凝集反应，如受检红细胞与抗 D 管凝集而与试剂对照管不凝集，可记录受检标本为阳性结果，不必作抗球蛋白试验；5.1.2.4.3.5 如不凝集，则用大量盐水洗涤细胞 34 次；最后一次洗涤后，把盐水倾倒干净，吸干试管边缘；5.1
37、.2.4.3.6 加 12 滴抗人球蛋白试剂(根据试剂说明书 ), 轻轻混匀，并以 9001000g离心 1530 秒；5.1.2.4.3.7 轻轻冲洗悬浮细胞扣并观察凝集反应；5.1.2.4.3.8 如果试验为阴性，加入已知 IgG 致敏红细胞，再次离心，检查凝集。5.1.2.4.4 结果判读5.1.2.4.4.1 抗 D 试管出现凝集而对照管无凝集时，是阳性结果，判为 RhD 阳性；5.1.2.4.4.2 抗 D 试管无凝集反应者是阴性结果，表明红细胞没有 D 抗原，判为 RhD 阴性；5.1.2.4.4.3 如果试剂对照管凝集，则不能对这次 RhD 阴性确认试验作出有效的解释，这种情况下
38、，对择期受血者，在 RhD 血型未确定前，应先输 RhD 阴性血液；如果受检细胞是献血员，该血液不应用于临床。5.1.2.4.5 注意事项5.1.2.4.5.1 确认试验中所选用的 IgM 抗 D 单克隆抗体所识别的 D 表位应与初筛使用的IgM 抗 D 识别的 D 表位不同。5.1.2.4.5.2 本项试验中所检出的不完全 D 表型的进一步分类需使用特殊的不完全 D 诊断试剂。5.1.2.4.5.3 可采用检测 RhD 基因的方法诊断 RhD 血型。5.1.2.5 红细胞血型抗体筛选与鉴定技术5.1.2.5.1 抗球蛋白试验抗球蛋白试验又称 Coombs 试验，是一种检查 IgG 抗体的方法
39、。将抗球蛋白试剂加入已致敏的红细胞盐水悬液中，致敏在红细胞表面的 IgG 抗体与抗球蛋白发生特异性反应，使红细胞发生凝集。5.1.2.5.1.1 直接抗球蛋白试验A. 原理直接抗球蛋白试验是检查体内致敏红细胞的一种方法，用于检查红细胞是否已被 IgG抗体所致敏，如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏） 、溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被受血者 IgG 抗体致敏） 、自身免疫性溶血性贫血（受血者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物，青霉素等所致） 。B. 试剂抗球蛋白试剂（广谱及单价） ；阳性对照管：取 D 阳性红细胞，经盐水洗涤后取压积红细胞，加等量 I
40、gG 抗 D 血清，置 37水浴致敏 45 分钟取出，以生理盐水洗涤 3 次后，离心除去上清液，再用盐水配成 35%红细胞盐水悬液。阴性对照管：正常人 5%D 阳性红细胞悬液（未致敏） ，供阴性对照用，除不用抗 D 血清致敏外，按上法配制。C. 方法a. 取受检红细胞，以生理盐水洗涤 3 次，末次洗涤后将上层盐水倒尽，用滤纸将管口附着的盐水吸去，配成 25%红细胞盐水悬液；b. 取上述 25%受检红细胞盐水悬液 1 滴，滴入小试管内，加抗球蛋白血清 1 滴，混匀。c. 阳性对照：IgG 抗 D 血清致敏的 25%D 阳性红细胞悬液 1 滴，加抗球蛋白血清 1 滴，混匀。d. 阴性对照：正常人
41、25%D 阳性红细胞悬液 1 滴加抗球蛋白血清 1 滴，混匀；e. 受检者以及阳性，阴性对照管同时离心 120g，1 分钟，或离心 1000g ，15 秒，轻轻混合，观察结果。D. 结果判定如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。E. 注意事项a. 标本采取后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上放出。b. 抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则，可产生前带现象，而误为阴性结果。c. 受检红细胞一定要用盐水洗涤 3 次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。d. 欲了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗 IgG、抗 Ig
42、M 或抗 C3单价抗球蛋白血清进行试验。e. 红细胞上吸附抗体太少，自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。f. 全凝集或冷疑集血液标本及脐血标本含有 Wharton 胶，洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集。5.1.2.5.1.2 间接抗球蛋白试验A. 原理用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的 IgG 抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。常用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，输血前交叉配血试验以及其它的特殊研究。B. 试剂与材料抗球蛋白血清（广谱及单价） ；受检血清（或已知抗体血清） ； 25%已知抗原的红细胞
43、悬液（或 35%受检红细胞悬液） ；IgG 抗 D 血清；25%D 阳性红细胞悬液,25%D 阴性红细胞悬液。C. 方法 a. 取试管 3 支，标明受检管，阳性对照及阴性对照；b. 在受检管内加入 2 滴血清（已知或受检）及 1 滴 25%红细胞悬液（受检或已知） ；在阳性对照管中加入 2 滴 IgG 抗 D 血清及 1 滴 25%D 阳性红细胞悬液；在阴性对照管中加入 2 滴 IgG 抗 D 血清及 1 滴 25%D 阴性红细胞悬液。混匀，置 37水浴 45 分钟用生理盐水洗涤 3 次。末次洗涤后，将上清液除尽，并用吸水纸将附着于管口的盐水吸去。每管各留红细胞悬液 1 滴；c. 每管各加最适
44、稀释度抗球蛋白血清 1 滴，混匀,9001000g 离心 15 秒，观察结果。D. 结果判定a. 阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，受检管不出现凝集为阴性。b. 效价滴定：如果受检者血清中检出 IgG 抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。E. 注意事项 a. 红细胞洗涤应迅速，洗涤不应中途停止。洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。b. 如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必须加入新鲜 AB 型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗 C3。5.1.2.5.2 凝胶凝集技术筛选和鉴定抗体5.
45、1.2.5.2.1 原理在微柱凝胶试验中，用特制的微柱代替普通试管，微柱内注入葡聚糖、蛋白 G 或玻璃微珠等物质，并可在这些物质上预先分别结合上抗球蛋白抗体。由于凝胶颗粒具有分子筛作用，抗原抗体反应后的红细胞通过离心经过微柱，无 IgG 结合的红细胞穿过凝胶到达底部，而红细胞上若有 IgG 抗体结合则会被凝胶中的抗 IgG 拉住，红细胞被阻止在凝胶柱上层或中间。5.1.2.5.2.2 标本与试剂5.1.2.5.2.2.1 如果待测的血清和血浆是冰冻保存的，血样在使用前需离心，确保没有颗粒物质；5.1.2.5.2.2.2 挑选抗 IgG 凝胶卡：检查每 1 个凝胶卡是否干涸是否完整，做好试验标记
46、，若是抗体筛选可选择 23 个微量管，抗体鉴定则需与多个微量管(根据试剂红细胞谱的细胞品种选择微量管数，并注意留有自身与阳性对照)；5.1.2.5.2.2.3 使用适用于微柱凝胶的试剂红细胞组，或参照试剂的要求制备红细胞悬液。通常配制 0.8%红细胞悬液。5.1.2.5.2.3 方法5.1.2.5.2.3.1 揭开凝胶卡的铝封,在不同的微量管中，根据试剂使用说明书的要求分别加入一定量的(通常 50l)不同的筛选或鉴定试剂红细胞；5.1.2.5.2.3.2 根据试剂使用说明书的要求在这些微量管中加入一定量的(通常 25l)血清或血浆；5.1.2.5.2.3.3 将凝胶卡置 37凝胶孵育箱 15
47、分钟；用凝胶试验离心机，离心观察结果。5.1.2.5.2.4 结果判读与解释5.1.2.5.2.4.1 细胞完全沉积在微量管底部为阴性结果；5.1.2.5.2.4.2 所有细胞仍留在微量管顶部为强阳性结果；5.1.2.5.2.4.3 凝集的强弱判断请参见图 5.1.2.1。图 5.1.2.1 凝胶检测反应级数图5.1.2.5.3 聚凝胺试验5.1.2.5.3.1 原理聚凝胺是一种由四个铵聚合而成的高阳离子聚合体。聚凝胺可使正常红细胞聚集，而在加入柠檬酸盐时又可使聚集的红细胞散开。当红细胞上有 IgG 抗体结合时，聚凝胺所造成的凝集是不可逆的。在此实验中，红细胞与血清在低离子介质中孵育，以促进抗
48、体结合到红细胞上。然后加聚凝胺，离心后通过加入柠檬酸盐使聚凝胺形成的凝集驱散。此时，由抗体介导的凝集在加入柠檬酸盐后仍然维持，而无抗体致敏的红细胞凝集则会散开。如果需使用加入柠檬酸盐后散开的红细胞做进一步的抗球蛋白试验，则散开后的细胞需先进过三次洗涤。5.1.2.5.3.2 试剂聚凝胺试剂盒：通常包括低离子介质(LIM)、聚凝胺溶液、重悬液：洗涤液(用于抗球蛋白试验)；抗人球蛋白试剂；IgG 致敏红细胞。5.1.2.5.3.3 方法根据试剂使用说明书进行操作，一般情况下包括以下步骤：5.1.2.5.3.3.1 各取 1 滴 35%受血者和献血员红细胞悬液，洗涤去上清，受血者红细胞中加入 0.1
49、ml 献血员血清，献血员红细胞中加 0.1ml 受血者血清；5.1.2.5.3.3.2 各加 1 mlLIM 溶液，混合，室温孵育 1 分钟；5.1.2.5.3.3.3 各加 0.1ml 0.05%聚凝胺应用液，混匀；5.1.2.5.3.3.4 离心 9001000g，10 秒钟，悬浮细胞扣，并观察是否已产生凝集；5.1.2.5.3.3.5 加 0.1ml 重悬液，轻轻摇动试管，并在 3 分钟内完成结果判读。5.1.2.5.3.4 结果判读当加入重悬液后，仍存在凝集为阳性反应。5.1.2.5.3.5 注意事项5.1.2.5.3.5.1 当使用低离子聚凝胺技术时，实验需有阴性对照。5.1.2.5.3.5.2 如果反应很弱，可用显微镜观察并与阴性对照比较，不可再次离心。5.1.2.5.3.5.3 聚凝胺方法对检测 Kell 系统的抗体不理想，所以对阴性结果须进行抗球蛋白试验，以免漏检。5.1.2.5.4 酶技术用于血库的酶制剂批与批之间均有差异，所以每次配制酶贮存溶液都需要测定其活力，为达到最佳效果，确定标准的孵育时间。5.1.2.5.4.1 无花果酶贮存液的制备(1) 将 1g 无花果蛋白酶倒入 100ml 容量瓶中，(注意！操作时须仔细，因为
