1、实验一 血清蛋白电泳(醋酸纤维薄膜法)目的了解电泳法分离蛋白质的原理、操作方法及临床意义。原理 带电荷的蛋白质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在 pH7 以下，若将血清置于 pH8.6 的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一 pH 环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、b-球蛋白和 g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。醋酸纤
2、维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。仪器与材料 1仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。2材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。试剂1巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥 2.21 克和巴比妥钠 12.36 克，溶于 500 毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至 1000 毫升。2染色液。称取丽春红 S0.4 克及三氯醋酸 6 克；用蒸馏水溶解，并稀释至 100 毫升。3漂洗液。3%(VV)醋酸溶液。4透明液。取无水乙醇 75 毫升和冰醋酸 25
3、 毫升混匀备用。50.4molL 氢氧化钠溶液。640%(VV)醋酸溶液。操作1薄膜的准备：取醋纤薄膜(2 厘米*8 厘米)在毛面的一端约 1.5 厘米处，用铅笔轻划一直线，表露点样位置并编号。然后将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。2点样。取少量血清置于普通玻璃板上，用点样器的钢口蘸取血清(约 35ml)，随后将钢口垂直“印”在点样线上，待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。3平衡与电泳。将已点样的薄膜加样面朝下，加样端置于阴极端，平整地贴于电泳槽的支架上拉直。支架上事先放置好两端浸入缓冲
4、液的用四层滤纸条作的“滤纸桥”(如图 2)。平衡数分钟至薄膜重又湿润时方可通电进行电泳。一般电压为 120160 伏，电流约 0.40.6 毫安厘米，通电时间 4050 分钟，待电泳区带展开约 3.5 厘米时断电。4染色。小心取出薄膜，直接浸于丽春红 S 染色剂中 510 分钟(以清蛋白区带染透为止)。然后在漂洗液中连续浸洗数次，使薄膜底色漂净，即得五条蛋白色带。从阳极端起依次为清蛋白、a 1、a 2、b 和 g-球蛋白。 5透明。若要保存薄膜，待薄膜完全干燥后，置透明液中 1020 分钟，取出贴于玻璃板上，干后则透明，可长期保存。6定量及计算。将漂洗净的薄膜吸干，剪下各蛋白色带，另于空白部位
5、剪一相当于清蛋白宽度的膜条做空白，分别置于 0.4molL NaOH 溶液的试管中，清蛋白管加 4 毫升，其余各管加2 毫升，振摇，使溶液浸没膜条后，置 37水浴 10 分钟，使其色泽浸出。再向各管加40%(VV)醋酸 0.4 毫升，清蛋白管则加 0.4 毫升，以中和部分 NaOH，使色泽变红色。取各管上清液用分光光度计，在 520nm 处，以空白管调工作零点后。分别测得清蛋白管、a 1、a 2、b和 g-球蛋白各管的吸光度值。 定量计算时，先计算各光密度值的总和：A T = 2A 清 + A a1 + A a2 + A b + A g再计算血清各部分蛋白质所占的百分率：Ax 表示各球蛋白组分 (a 1、a 2、b 和 g ) 的吸光度。 若条件许可，也可将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析与计算。 血清蛋白醋纤薄膜电泳的参考正常值为：白蛋白 6271 %a 1球蛋白 34 %a 2-球蛋白 610 %b-球蛋白 711 %g-球蛋白 918 %
