1、动物科技学院 兽医硕士 冯柳柳 20131201811.举例说明原核基因表达调控的详细机制原核生物是一些由无真正的细胞核的细胞组成的单细胞或多细胞的低等生物。原核生物包括古菌（有时单独分类为古核生物）和细菌（真细菌，其中包含支原体和蓝藻门，有时“原核生物” 一词仅指真细菌） 。一般没有细胞内膜，没有细胞核膜，但依然有遗传物质，例如：DNA、RNA 等。原核生物的 DNA 伴随些许蛋白质和核糖体，并以游离的形成存在于细胞质中。原核生物包含蓝绿菌和细菌，细菌一型态又可分为杆菌、球菌、螺旋菌。在双链 DNA 中，作为转录模板的链称为模板链（template strand）或反义链（antisense
2、 strand） ；而不作为转录模板的链称为 编码链（coding strand）或有义链（sense strand） ，编码链与模板链互补，它与转录产物的差异仅在于 DNA中的胸腺嘧啶（T）变为 RNA 中的尿嘧啶（U） 。在含许多基因的 DNA 双链中，每个基因的模板链并不总是在同一条链上，亦即可作为某些基因模板链的一条链，同时也可以是另外一些基因的编码链。原核基因的表达包括转录和翻译两个过程。元和基因的表达调控主要表现在：转录水平的调节和转录后水平的调节。一、转录水平的调控1、 因子的选择性使用原核生物识别启动子序列的是 因子。不同的 因子可识别不同的启动子序列，E. coli 主要使用
3、 70。在特殊的条件下，其它类型的 因子被表达或被激活。这些新的 因子识别的是其它类型的启动子，其一致序列不同于70 所识别的启动子，从而指导 RNA pol 启动一些新基因的表达。这样的调控系统使有机体能够对在特定条件下需要表达的多个基因进行统一的调控。 2、操纵子调控一些功能相关的结构基因成簇存在，构成所谓的多顺反子，它们的表达作为一个整体受到控制元件的调节。控制元件由启动子、操纵基因和调节基因组成。调节基因编码调节蛋白，与操纵子结合而调节结构基因的表达。 3、几种重要的操纵子（1）乳糖操纵子乳糖操纵子属于诱导型操纵子，其天然的诱导物是乳糖的异构体别乳糖，它既受到负调控，又受到正调控。其详
4、细调控机制为：lacZ 编码 -半乳糖苷酶，催化很少一部分乳糖异构化为别乳糖，绝大多数乳糖水解为半乳糖和葡萄糖；lacY 基因编码半乳糖透过酶，其功能是使环境中的 -半乳糖苷能透过细胞壁和细胞膜进入细胞内；lacA 基因编码转乙酰基酶。转录时，RNA 聚合酶首先与 Plac 结合，通过 lacO 向右，按 lacZlacYlacA 方向进行转录，每次转录出来的一条 mRNA 上都带有这 3个基因。葡萄糖效应在有葡萄糖存在时，细菌优先利用环境中的葡萄糖，即使有诱导物乳糖的存在，乳糖操纵子也处于被抑制的状态，直到葡萄糖被消耗完后才能解除抑制，这时细菌才开始利用乳糖进行生长。这说明乳糖的存在仅仅是乳
5、糖操纵子开放的必要条件，但还不是充要条件。乳糖和葡萄糖同时存在的情况下，乳糖操纵子也不能正常开放的原因是乳糖操纵子的开放还需要一种称为 cAMP 受体蛋白（CRP）的激活蛋白的正调控。只有在负调控不起作用、正调控起作用的条件下，乳糖操纵子才能开放。 （2）麦芽糖操纵子麦芽糖操纵子控制几个与麦芽糖吸收和分解有关的酶基因的表达。受到调控的结构基因一个是 malP编码麦芽糊精磷酸化酶促进麦芽糖运输到细胞内，另一个是 malQ编码麦芽糖酶，将进入细胞的麦芽糖水解成葡萄糖。与乳糖操纵子相似的是，它也属于诱导型操纵子，也受到 CAP-cAMP 的激活。但与乳糖操纵子不同的是，作为诱导物的麦芽糖不是与阻遏蛋
6、白结合，导致阻遏蛋白的失活，而是与激活蛋白MalT 结合，激活 MalT。在没有葡萄糖的条件下，被激活的 MalT 与 CAP-cAMP 一道打开麦芽糖操纵子，使 malP 和malQ 得以表达。（3）大肠杆菌的色氨酸操纵子色氨酸操纵子是一种阻遏型的操纵子，它控制 5 种参与色氨酸合成酶基因的表达。色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合而阻止色氨酸操纵子的表达。当色氨酸含量低时，阻遏蛋白没有结合 DNA 的活性。这时，操纵基因区域便可以同RNA pol 结合，转录得以进行，表达参与色氨酸合成的基因，补充细胞内色氨酸的含量；当色氨酸充足时，它作为辅阻遏物同阻遏蛋白结合后，会引起阻遏蛋白构象变化，使其能
7、够同操纵基因结合，阻遏色氨酸合成基因的转录。色氨酸合成途径的终产物会通过阻遏转录的进行抑制该途径酶的合成。二、转录终止阶段的调控抗终止作用转录的终止依赖于终止子。但不同终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全终止转录；有的则只是部分终止转录，一部分 RNA pol 能越过这类终止序列继续转录。如果操纵子的结构基因群中间有弱终止子存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白质因子能作用于终止子序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用，这些蛋白因子就称为抗终止因子。当然也有一些蛋白质因子能够促进终止子的作用。两种情况都可以用来调节基
8、因的表达， 例：BglG 蛋白的抗终止作用三、翻译水平上的调控1、反义 RNA 的正负调控反义 RNA 是指与特定目标 RNA 分子（通常是 mRNA）因存在互补序列，而发生配对从而调节目标 RNA 功能的 RNA 分子。它通常是以一个基因编码链的部分序列为模板而转录而成，并不编码任何蛋白质。反义 RNA 可参与 DNA 复制和基因转录的调控，而其对基因转录的调控主要在翻译水平上，少数在转录水平上，反义 RNA 可能起负调控，也可能起正调控的作用。 DrsA 是在大肠杆菌中发现的又一种反义 RNA，它既可以和 hns mRNA 互补配对，还可以和 rpoS mRNA 互补配对，但对这两种 mR
9、NA 的翻译影响正好相反，前一种配对掩盖了 hns mRNA5-端的核糖体结合位点（ RBS） ，从而导致翻译受阻，后一种配对则暴露出 rpoS mRNA 上的 RBS，从而激活翻译。2、翻译控制翻译控制是指转录产物本身的结构控制其翻译的过程。例如，pyrC 基因编码嘧啶核苷酸合成途径中的二氢乳清酸酶，然而，细胞内嘧啶浓度的变化并不影响到 pyrC 基因的转录水平，但能影响到转录的序列。pyrC 的转录可以从5-CCGG-3任何位置开始，但是，如果细胞内的嘧啶过量，转录倾向于从C2 开始，这样的转录产物会形成一种茎环结构而将核糖体结合位点隐藏起来，致使翻译无法进行；相反，如果细胞内的嘧啶量有限
10、，转录倾向于从 G4 开始，而这样的转录物不会形成掩盖核糖体结合位点的茎环结构，于是二氢乳清酸酶能得到正常的翻译。3、自体调控自体调控是指一个基因产物对自己的基因表达产生激活或抑制的现象。它既可以在转录水平上，也可以在翻译水平上进行。例如：T4 噬菌体 p32 蛋白的自体调控p32 是由 T4 噬菌体基因组编码的一种蛋白质，它参与 DNA 重组、修复和复制，它与单链 DNA 结合的亲和力特高，这种性质与其功能有关。如果细胞内没有单链 DNA 结合位点，它便与自己的 mRNA 上位于起始密码子周围富含AT 的序列结合，阻止自身的翻译。核糖体蛋白的自体调控核糖体蛋白的基因组织成多个操纵子，大多数操
11、纵子含有组成大、小亚基的核糖体蛋白的基因，某些与翻译有关的蛋白质的基因也包含在内。在每一个核糖体的操纵子上都有一个基因（总是核糖体蛋白基因）兼做调节基因，其蛋白质产物能够与自己的 mRNA 5-端结合，从而抑制自身的翻译。 4、mRNA 的二级结构和稳定性对翻译的调控mRNA 的二级结构不仅可以影响到 mRNA 的稳定性，还会影响到核糖体结合位点的可得性。单核细胞增生性李斯特菌是一种能够导致食物中毒的人类病原菌，其毒性基因只有在菌体进入宿主内才会表达。控制毒性基因表达的源头在温度。PrfA 是一种激活蛋白，它负责激活与毒性有关的基因表达。有趣的是 PrfA 在 37C 表达，在 30C 则不表
12、达，可是它的转录在两种温度下都能进行，看来控制的位点只能是在翻译的水平上了。原来在 30C 或者更低的温度下，PrfA mRNA 上的 SD 序列与其它区域配对形成链内双链，致使核糖体结合位点被掩盖，翻译因此受到抑制；在 37C 下，配对区域热变性， SD 序列暴露，核糖体可以结合，翻译便可以进行了。既然 mRNA 是翻译的模板，那么它的稳定性越高就会有更多的时间被翻译，因此，如果能够通过某种手段控制一种 mRNA 的稳定性，也就多了一种在翻译水平上调节基因表达的渠道。但由于原核细胞的 mRNA 本来就很不稳定，所以，在原核细胞利用此手段来调控基因表达的并不多见。RyhB RNA 是大肠杆菌的
13、一种小分子 RNA，仅在铁饥饿的情况下表达。在铁供应不足的条件下，这种 RNA 与胞内 6 种与铁储存的蛋白质 mRNA 配对结合，形成双链区域，致使被结合的 mRNA 更容易被 RNA 酶 E 水解；但在高铁的情况下，RyhB RNA 的表达受阻，于是参与铁储存的蛋白质的 mRNA 稳定性提高，翻译效率因此提升。5、稀有密码子对翻译的影响dnaG、rpoD 及 rpsU 属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这 3 个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内 50 个拷贝的 dnaG 蛋白，2800 个拷贝的 rpoD 蛋白； 40000 个拷贝的 rpsU 蛋白。基因转录出来的三个蛋白相应的
14、mRNA 拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。研究 dnaG 序列发现其中含有不少稀有密码子。分别计算大肠杆菌中 25 种结构蛋白和 dnaC、rpoD 序列中 64 种密码子的利用频率，可以看出 dnaG 与其他两类有明显不同。很明显，稀有密码子 AUA 在高效表达的结构蛋白及 因子中均极少使用，而在表达要求较低的 dnaG 蛋白中使用频率就相当高。许多与 dnaG 一样含量少的蛋白，由于细胞内对应于稀有密码子的 tRNA 较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。2.详细说明明动物体内血糖降低时神经内分泌调控的生理生化机制当血糖含
15、量降低时，促使胰岛 A 细胞释放谷氨酸盐。谷氨酸盐接着作用于AMPA 和 kainate 型的促离子型谷氨酸受体，并使得细胞膜去极化，钙离子通道被打开，最终使得细胞质中的自由钙离子浓度增加，从而促进胰高血糖素的释放。肾上腺髓质分泌肾上腺素，同时启动下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴促进糖皮质激素的分泌。胰高血糖素释放，糖原磷酸化酶激酶和糖原磷酸化酶引起 cAMP 的级联作用，使丙酮酸激酶发生磷酸化，从而失去活性，抑制糖酵解。肾上腺素作用于骨骼肌细胞，促使糖原分解，使得肌糖原分解，血糖升高。肾上腺素和胰高血糖素共同促进糖异生的作用： 诱导肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸的生成促进脂肪动员，脂肪酸分解乙酰 CoA
16、,乙酰 CoA 激活丙酮酸羧化酶。甘油：糖异生的原料。肾上腺髓质激素：可以促进肝糖原分解，从而使血中游离脂肪酸增多，这些都有助于机体在应急状态下对能量的需要。同时，还可通过对胰岛 B 细胞上a 受体作用，抑制胰岛素分泌，以利于血糖升高。糖皮质激素：诱导肝脏合成糖异生的四种关键酶，特别是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶。 促进肝外组织蛋白分解，抑制外周组织对氨基酸的利用而异生成肝糖原，还能促进脂库动员。此外，糖皮质激素还有抗胰岛素的作用，通过肌肉、脂肪等组织对胰岛素的反应性，使外周组织对葡萄糖的利用减少，从而使血糖浓度升高。甲状腺激素：T3 和 T4 可促进机体对糖的吸收和肝糖原的分解，同时可促进各组织加
17、速对糖的利用。此外，甲状腺激素还可加强肾上腺素、胰高血糖素、皮质醇和生长激素升高血糖的作用。糖异生与糖酵解作用的相互调节磷酸果糖激酶（PFK）和果糖-1、6-二磷酸酶的调节：当 ATP 和柠檬酸水平高时， PFK 受抑制，降低糖酵解的速率，柠檬酸增加果糖-1、6-二磷酸酶活性，从而增加糖异生速率。3.详述在你论文设计中可能用到的现代生化与分子技术的原理和流程 论文内容：减蛋综合征病毒的致病性结合论文设计，我的实验可能用到的生物化学和分子生物学技术主要有：引物设计、荧光定量 PCR、ELISA1.引物设计：原理：PCR 引物设计的 11 条黄金法则1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。D
18、NA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment） ，各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度（primerlength ）常用的是 18-27bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 TaqDNA 聚合酶进行反应。3.引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72。GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值（meltin
19、gtemperature ）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 510。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T ）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580 ，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。4.引物 3端要避开密码子的第 3 位。如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物 3端不能选择 A，最好选择 T。引物 3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而
20、当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 T。6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming） 。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模
21、板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G 值不要过高（应小于 4.5kcal/mol） 。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。8.引物 5端和中间G 值应该相对较高，而 3端G 值较低。G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5端和中间G 值相对较高，而 3端
22、G 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。 （不同位置的G 值可以用 Oligo6 软件进行分析）9.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。引物的 5端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。10.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无
23、效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。11.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互性，就可以进行下一步的实验了。流程: 1.查文献，了解目的基因的测序情况，并汇总和个人工作相关的基因及其氨基酸序列。然后，用 clustal w2
24、进行比对（该软件可以在线使用，www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html）2.根据比对结果，可以确定出保守碱基在 cDNA 中的大体区域，再根据引物设计的要求来确定引物位置。3.大体确定引物扩增序列的长度，尽量可以包括所有的保守碱基。不过不宜太长。3.利用 Primer 5.o 分析确定上游和下游引物。 现在的软件都是直接给出引物序列的，不需要进一步的碱基配对，方向都是 5-3荧光定量 PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国 Applied Biosystems 公
25、司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量 PCR 原理：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在 DNA 任意一条单链上; PCR 扩增时， Taq 酶的 5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有
26、一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。荧光定量 PCR 流程：样品 RNA 的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30孵育 2 到 3 分钟。4下12000rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合
27、以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30 孵育 10 分钟后，于 4下12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA 清洗 移去上清液，每 1mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1ml的 75%乙醇（ 75%乙醇用 DEPCH2O 配制） ，清洗 RNA 沉淀。混匀后，4下7000rpm 离心 5 分钟。RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥5-10 分钟。溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40l 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-8
28、0待用。RNA 质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定RNA 溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260 下读值为 1 表示 40g RNA/ml。样品 RNA 浓度计算公式为：A260 稀释倍数 40g /ml。具体计算如下：RNA 溶于 40l DEPC 水中，取 5ul，1:100 稀释至 495l 的 TE 中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40g/ml = 840g/ml 或 0.84g/l取 5ul 用来测量以
29、后，剩余样品 RNA 为 35l，剩余 RNA 总量为：35l 0.84g/l = 29.4g纯度检测RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。(2)变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60，10 ml 的 10 MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS 电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.0、0.1M 乙酸钠、0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25l 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1MOPS 电泳缓冲液至覆
30、盖胶面几个毫米。准备 RNA 样品取 3gRNA，加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为 10g/ml。加热至 70孵育 15 分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。5 6V/cm 电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 23cm。紫外透射光下观察并拍照28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型） ，上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和 28S 核糖体带之间可以
31、看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。样品 cDNA 合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录 buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶 MMLV 0.5l6 DEPC 水 5l7 RNA 模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。混合液在加入逆转录酶 MMLV 之前先 70干浴 3
32、 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5l，37水浴 60 分钟。取出后立即 95干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于-80 待用。样品管家基因（-actin）实时定量 PCR-actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011，反应前取3l 按 10 倍稀释（加水 27l 并充分混匀）为 1010，依次稀释至109、108、107 、106、105、104 ，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 阳性模板上游引物 F 0.5l3 阳性模板下游引物 R 0.5l4 dNTP
33、 0.5l5 Taq 酶 1l6 阳性模板 DNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。管家基因反应体系：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 内参照上游引物 F 0.5l3 内参照下游引物 R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq 酶 1l6 待测样品 cDNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932 分钟，然后 93 1 分钟，55 2 分钟，共 40 个循环。模板针对每一需要测量的基因，选择
34、一确定表达该基因的 cDNA 模板进行PCR 反应。反应体系：序号 反应物 剂量1 10PCR 缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物 F 0.5 ul4 下游引物 R 0.5 ul5 dNTP 混合液 3 ul6 Taq 聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。35 个 PCR 循环（941 分钟；55 1 分钟；72 1 分钟） ； 72延伸 5分钟。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。将 PCR 产物进行 1
35、0 倍梯度稀释 : 设定 PCR 产物浓度为 11010，依次稀释至 109、 108、107、106、105、104 几个浓度梯度。PCR所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。体系配置如下：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq 聚合酶 2ul6 待测样品 cDNA 5ul7 ddH2O 30ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。反应条件为：932 分钟预变性，然后按 93 1 分
36、钟，551 分钟，721 分钟，共 40 做个循环，最后 727 分钟延伸。电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView 染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。ELISA 实验原理：ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物
37、质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA 实验步骤：器材和溶剂：待检血清， 酶标二抗， 底物，载体，包被缓冲夜，封闭液，底物缓冲液，洗涤液 ，步骤：（1）抗原包被酶标板：A 制备包被液：用包被液稀释抗原B 用排枪吸取包被液至酶标板中，每孔 100ul，放于 37C 的培养箱中 1-2 h。或 4C 冰箱过夜。C
38、漂洗：倒出液体，注满洗涤液，放 3 分钟后拍去，重复 3 次，排干备用。最好在洗板机上操作。（2）加封闭液：将配好的封闭液按每孔 200 ul 加入， （37C 培养 1h。 ）25RT ？（3）加待检血清：A 加样品，待检血清用封闭液稀释后加入酶标板，每孔 100ul，做好标记，放于 37C 的培养箱中 1 h。B 漂洗：重复上部。（4）加酶标二抗：A 每孔加酶标抗 100ul，37C 培养 1h，B 漂洗：重复上部。（5）加底物溶液。显色A 底物溶液的配制。B 每孔加底物溶液 100ul 避光置温室 1530 分钟。C 加硫酸（ 1mol/L）50ul. ，反应终止。（6）测定：测定各空 OD 值。
