1、利用生物信息学方法开发鹌鹑微卫星标记白俊艳，庞有志，赵淑娟（河南科技大学动物科技学院，471003）摘要：本研究对已公布的鹌鹑核酸序列和 EST 序列总计 635 条序列中 16 核苷酸重复SSR 的分布进行了分析。结果表明，其中共发现 120 条 SSR，检出率为 18.9%。二核苷酸重复基元的 SSR 占 40.0%，三核苷酸重复基元的 SSR 占 35.8%，五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的 SSR 类型，分别占 14.2%和 10.0%，没有发现六核苷酸重复基元的 SSR。组成这些 SSR 的主要基序有AT/TA，CA/GT，GA/CT，CAG/GTC，AGG/TCC，TAA/AA
2、T，GGC/CGG，GAC/CTG，CGA/GCT，GCA/CGT，GAG/CTC，ACC/CCA，TCTT，TTTG，TCCA，ATGAT/ATCAT，TCCCT，TTCCC。并且 SSR 的重复次数都在 5 以上，由此可以推测利用鹌鹑核苷酸序列和 EST 序列中的 SSR 序列将有可能开发一批有价值的 SSR 分子标记供各种研究所用，还有助于鹌鹑高密度遗传图谱的构建、重要功能基因克隆及基因功能等研究。关键词：鹌鹑；微卫星；生物信息学方法鹌鹑分为野生鹌鹑和家养鹌鹑两类。野生鹌鹑主要有野生普通鹌鹑和野生日本鸣鹑两种野生普通鹌鹑。鹌鹑具有体型小、产蛋能力强、繁殖快、易饲养、耗料少等特点，因而具有
3、较高的经济价值，同时还因其敏感性好、世代间隔短，是一种很好的实验动物，可供营养学、遗传学、疾病学、组织学、胚胎学、生理学、繁殖学、药理学等学科方面的实验和研究。然而，现阶段对鹌鹑的遗传资源研究不多，对于分子遗传标记领域的研究报道比较少。微卫星（microsatellite ）是 DNA 序列中以 16 个碱基为一个重复单位，重复一般在1020 次左右，首尾相接的串联重复序列，又称为简单序列重复 DNA（SSR） 。目前微卫星标记已经广泛应用于牛、猪、羊等家畜的遗传育种中，主要包括个体识别和品系鉴定，群体遗传结构与遗传关系分析，功能基因和 QTL 定位，构建基因图谱，杂种优势预测。微卫星标记在鹌
4、鹑中的研究报道比较少，Kayang 等 1（2004 ）开发了鹌鹑 100 多个的微卫星标记，并首次绘制了鹌鹑的部分遗传连锁图谱。Kayang 等2（2006）利用 AFLP 和 SSR标记构建了鹌鹑的部分染色体的遗传连锁图谱。到目前为止，已经开发的鹌鹑的微卫星标记仍然为数不多。随着生物技术、生物信息学的发展，GeneBank 、DDBJ 等国际生物学公共数据库中核酸序列信息也在不断增多，为我们开发鹌鹑微卫星标记提供了条件。利用生物信息学方法从这些数据库中检索 SSR 序列无疑是一个简便快速的方法。这种方法节省了传统微卫星开发过程中的大量测序费用，也节省了大量人力，因此具有广阔的应用前景。本研
5、究的目的就是利用生物信息学方法开发鹌鹑的新微卫星标记，为开展鹌鹑遗传多样性研究、品种鉴定、比较基因组研究、进一步完善鹌鹑遗传连锁图谱等工作提供更方便实用的标记。1 材料与方法首先，对 NCBI 中的公共数据库 Genebank 中的所有鹌鹑核酸序列和 EST 序列进行检索，网站为：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/。然后，用微卫星在线搜索工具 SSRIT 从这些鹌鹑序列中查找微卫星，网站为 http:/www.gramene.org/db/searches/ssrtool。最后将找到的微卫星利用 http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
6、进行序列同源比对，对于获得的 SSR 进行统计分析。2 结果与分析2.1 鹌鹑 SSR 的检出率截至于 2009 年 4 月底，从 NCBI 网站上检索到鹌鹑的 496 条核苷酸序列和 139 条 EST序列，总计 635 条序列。其中共发现 120 条 SSR，检出率为 18.9%。2.2 鹌鹑不同重复核苷酸数 SSR 分布表 1 SS 不同重复核苷酸数的数量及百分比重复核苷酸数 SSR 数量（条） 占所有 SSR 的百分比（ %）二核苷酸 48 40.0三核苷酸 43 35.8四核苷酸 12 10.0五核苷酸 17 14.2SSRs 总数 120不同重复核苷酸 SSR 在鹌鹑的基因组中并不
7、是均匀分布的，由表 1 可以看出，二核苷酸重复基元的 SSR 类型最多，占总数的 40.0%，其次是三核苷酸重复基元的 SSR 类型，占35.8%，最少的是五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的 SSR 类型，分别占 14.2%和10.0%。而且，在鹌鹑中没有发现单核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元的 SSR。2.3 鹌鹑各种 SSR 分布鹌鹑各种 SSR 的分布见表 2 和表 3，可以看出，在 48 条含有二核苷酸重复基元的SSR 中，含有 AT/TA 重复基元的数量最多，有 17 条，占 35.4%，其次是 CA/GT 和GA/CT 重复基元的，分别占 33.3%和 31.3%，并且没有发现
8、GC/CG 重复基元的 SSR。在43 条含有三核苷酸重复基元的 SSR 中，含有 CAG/GTC 重复基元的数量最多，占 20.9%，其次是 AGG/TCC，占 18.6%，然后依次是TAA/AAT、GGC/CGG、GAC/CTG 、CGA/GCT、GCA/CGT 、GAG/CTC、ACC/CCA，数量最少的只有 1 条，他们是 CCT、TTG 、CGC 、GAT。在 12 条含有四核苷酸重复基元的SSR 中，含有 TCTT 重复基元的数量最多，占 25.0%，其次是 TTTG 和 TCCA，分别占16.7%和 16.7%。在 17 条含有五核苷酸重复基元的 SSR 中，含有 ATGAT/A
9、TCAT 重复基元的数量最多，有 8 条，占 47.1%，其次是 TCCCT 和 TTCCC，分别占 23.5%和 23.5%。表 2 二核苷酸基元和三核苷酸基元的 SSR重复单元数 重复单元 SSR 数量（条） 百分比（% ）二核苷酸 GA/CT 15 31.3CA/GT 16 33.3AT/TA 17 35.4GC/CG 0 0.0三核苷酸 TTA/AAT 4 9.3GGC/CGG 3 7.0GAC/CTG 3 7.0CAG/GTC 9 20.9CGA/GCT 3 7.0GCA/CGT 3 7.0AGG/TCC 8 18.6GAG/CTC 3 7.0ACC/CCA 3 7.0CCT 1 2
10、.3TTG 1 2.3CGC 1 2.3GAT 1 2.3表 3 四核苷酸基元和五核苷酸基元的 SSR重复单元数 重复单元 SSR 数量（条） 百分比（%）四核苷酸 TCTT 3 25.0TTTG 2 16.7TCCA 2 16.7TCCT 1 8.3CCAT 1 8.3TTAT 1 8.3AAAT 1 8.3AACA 1 8.3五核苷酸 ATGAT/ATCAT 8 47.1TCCCT 4 23.5TTCCC 4 23.5CTTCC 1 5.92.4 鹌鹑 SSR 的重复次数分布在 120 条 SSR 中，发现重复次数最多的是重复 5 次，有 53 条 SSR，占 44.2%；其次是重复次数为
11、 6 次的，有 36 条 SSR，占 30%；其次是 7 次和 8 次的，而重复次数为 9 次和 22 次的为最少，只有 1 条 SSR。图 1 SSR的 重 复 次 数 分 布01020304050605 6 7 8 9 10 12 15 18 22重 复 次 数SSR条数3 讨论本研究对已公布的鹌鹑核酸序列和 EST 序列中其 16 核苷酸重复 SSR 的分布进行了分析，结果表明，二核苷酸重复基元的 SSR 占总数的 40.0%，三核苷酸重复基元的 SSR 类型，占 35.8%，五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的 SSR 类型，分别占 14.2%和 10.0%。并且 SSR 的重复次数都
12、在 5 以上，由此可以推测利用鹌鹑核苷酸序列和 EST 序列中的SSR 序列将有可能开发一批有价值的 SSR 分子标记供各种研究所用。同时发现，利用生物信息学方法开发 SSR 有以下几个特点：首先，生物信息学方法开发 SSR 简便、快捷、可以节省人力财力；其次，生物信息学方法可以开发出更高核苷酸重复基元的 SSR，如三、四、五、六核苷酸重复基元的 SSR，而其他方法开发的 SSR 多为二核苷酸重复基元的SSR；最后，生物信息学方法开发的 SSR 的重复次数不是很高，多数在 58 次重复范围，这也可能与这些 SSR 是位于基因内部有关，其保守性可能比较好。尽管 SSR 具有广泛的用途，但是其开发
13、过程却是相当费时费力，目前 SSR 标记的开发有 4 种方法：文库筛选法，基于锚定 PCR 技术的方法，生物信息学方法，转移扩增法。文库筛选法是目前最常用的方法，虽然采用文库富集法可以使 SSR 开发效率（功能引物数/测序克隆数）达到 40%60%，但是无论单引物延伸富集法 3，4 ，还是选择杂交富集法 5，6 ，都存在过程烦琐复杂、技术要求高等缺点。Hayden 和 Sharp 11在锚定 PCR 的基础上发明了 SAM 法。随着更多的动物基因组序列、mRNA 序列不断增加，生物信息学方法将会成为一种简便、快速、实用的微卫星开发方法。参考文献：1 Kayang B B, Vignal A,
14、Inoue-Murayama M A et al. First-generation microsatellite linkage map of the Japanese quail. Anim Genet. 2004, 35(3): 195-200.2 Kayang B B, Vignal A, Inoue-Murayama M A et al. Integrated maps in quail (Coturnix japonica) confirm the high degree of synteny conservation with chicken (Gallus gallus) de
15、spite 35 million years of divergence. BMC Genomics, 2006, 7:1-18.3 Fisher P J, Richardson T E, Gardner R C, et al. Characteristics of single- and multi-copy microsatellites from Pinus radiata. Theor Appl Genet, 1998, 96: 9699794 Varghese J P, Rudolph B, Uzunova M I, et al. Use of 5-anchored primers
16、for the enhanced recovery of specific microsatellite markers in Brassica napus L. Theor Appl Genet, 2000, 101:1151195 李明芳，郑学勤.开发SSR引物方法之研究动态.遗传, HEREDITAS ,2004,26(5):7697766 Hayden M J, Stephenson P, Logojan A M, et al. A new approach to extending the wheat marker pool by anchored PCR amplification of compound SSRs. Theor Appl Genet, 2004, 108:733742作者简介：白俊艳（1975） ，女，博士，副教授，2005 年毕业于中国农业大学，现工作于河南科技大学动物科技学院，主要研究方向为动物遗传育种，通讯地址：河南省洛阳市涧西区天津路 70#河南科技大学动物科技学院，邮编：471003，E-mail:
