1、 壳聚糖直接作为固定化酶载体壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料,耐热性好,其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面,对蛋白质有显著的亲合力 ,可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。李志国等 4 以壳聚糖为载体,用物理吸附固定化脂肪酶,对影响固定化过程的各种因素进行考察,确定最优条件,结果表明:固定化酶的可操作性优于游离酶。以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶,酶不易失活,但酶与载体之间的结合力弱,在使用过程中酶分子易从载体上脱落,因此,多数情况下用吸附 交联法以提高其稳定性。最常用的交联剂是甲醛和戊二醛 5, 6 ,但更多采用戊二醛。吴茜茜等 9 研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪
2、酶固定化的影响。蔡俊等 10 对谷胱甘肽硫转移酶的固定化、游离酶和固定化酶的酶学特性进行了研究,通过试验确定谷胱甘肽硫转移酶的最佳固定化条件为先用 2%壳聚糖吸附酶,然后再加戊二醛交联,戊二醛浓度 1.2%,交联时间为 16h。王俊等 11 以壳聚糖为载体,采用戊二醛为交联剂的方法来固定海藻糖合成酶。赵江等 12 采用壳聚糖吸附和戊二醛交联的方法,将胃蛋白酶固定于壳聚糖上。壳聚糖衍生物作为固定化酶载体壳聚糖只能酸溶或溶于酸性水溶液 ,不能溶于有机溶剂。为了改善它的物理和化学特性可对壳聚糖进行化学修饰 ,如酰基化、 羧基化、 醚化、 Schiff反应、 N2 烷基化、 酯化、 氧化、 卤化、 接
3、枝共聚、 络合等反应 ,生成一系列具有不同性能的衍生物 28 ,可用作固定化酶的载体。壳聚糖在甲醇 /乙酸介质中与过量醛进行 Schiff 碱反应 , 可生成醛亚胺化衍生物。魏荣卿等 29 以壳聚糖为载体 ,与双醛淀粉反应形成酶柔性固定化模型 (Chit osan2 DAS50) ,对木瓜蛋白酶进行柔性固定化 ,在酶用量为 14 . 4 mg/g (酶 /干球 )、 pH 8 的条件下 ,固定木瓜蛋白酶 18 h,所得的固定化酶活力回收率达 72% ,相当于采用壳聚糖 戊二醛 (Chit osan,G A)载体的 3 倍。雷福厚等 30 将壳聚糖制备成壳聚糖铜高分子络合物 ,以配位键的形式对多
4、酚氧化酶进行固定化 , ,过程为:PNH2 + Cu2 -P NH2Cu2 + enzymeP NH2Cu-enzyme壳聚糖上的 - NH2 可以与 Cu2 +形成高分子络合物。由于高分子键的刚性作用 ,此络合物的 Cu2 +配位未饱和 ,可以进一步与酶中的游离氨基配位 ,使酶以配位键的形式固定在壳聚糖上 ,此方法称为高分子配位键法。这种方法制备简单 ,酶损失少。壳聚糖铜固定化多酚氧化酶在最佳 pH 值、 热稳定性、 底物对酶的抑制及米氏常数等方面均表现出酶催化特征。说明以功能高分子化合物为载体 ,以 Cu2 +为配位中心 ,通过配位桥键的形式将酶固定在高聚物上 (即高分子配位键法 ) 是可
5、行的。宋扬等 31 以壳聚糖微珠为载体 ,以 CuS O4 络合、 甲醛改性、 表氯醇 (32 氯 2 1 , 2 2 环氧丙烷 )和氨水修饰 ,戊二醛活化 ,偶联牛胰蛋白酶配基 ,制成抑肽酶亲和吸附剂 化学改性与修微球壳聚糖固定化胰蛋白酶。方法过程简单 ,样品酶比活为 5 700 KI U / mg,质量稳定 ,成本较低 ,且该吸附剂机械强度高 ,抗污染能力较强 ,非特异性吸附较小 ,可以反复使用 ,价格低廉 ,适合工业化生产。由于微球壳聚糖载体分子上存在大量游离氨基 ,化学性质极其活泼 ,表现为 pH 有缓冲作用 ,且能与酶催化产物醌反应。为解决上述问题 ,肖厚荣等 32 先用 Cu2 +
6、与壳聚糖上的部分氨基络合 ,将其保护起来 ,然后在弱碱性条件下使微球壳聚糖与中性甲醛反应 ,未络合的游离氨基及乙酰氨基转变成化学性质不活泼的一羟基或二羟基氨基。载体经化学修饰 ,增加反应基团数 ,从而提高吸附容量和固定化酶单位活力。比较试验表明:经修饰后壳聚糖偶联多酚氧化酶比对照高 2 . 3 倍。刘峥等 33 以过硫酸钾 /亚硫酸氢钠为引发体系制备丙烯腈接枝壳聚糖的共聚物 ,并以其为载体固定化 2 淀粉酶探讨固定化酶的最佳制备条件和固定化酶的性质 ,并与游离酶壳聚糖作为载体的固定化 2 淀粉酶进行了比较 ,结果表明:丙烯腈接枝壳聚糖共聚物是固定化 2 淀粉酶的优良载体。袁春桃等 34 也以接
7、枝共聚物壳聚糖 2 g2 丙烯腈作为载体固定化木瓜蛋白酶 ,试验表明:壳聚糖 2 g2 丙烯腈可以较好地吸附、 包结木瓜蛋白酶 ,固定化酶的酶活力较高 ,且稳定性得到提高。方波等 35 以壳聚糖为原料 ,采用反相悬浮交联的方法制取微球型壳聚糖颗粒 ,再进行羟丙基氯化及胺基化 ,制备一系列新型壳聚糖胺基衍生物微球。他在壳聚糖微球的分子结构中分别引入羟丙基和不同种类的胺基 ,使其结构中胺基含量上升 ,碱性增强 ,成为新型壳聚糖胺基衍生物微球 ,并初步考察其吸附牛血清白蛋白 (BS A) 性能。方波等 36 还研制了新型壳聚糖胺基衍生物 乙二胺羟丙基壳聚糖 ( EDA2HPCS) ,并将其用于固定天
8、门冬酰胺酶。Zhang、 Gong 等 37 用聚乙二醇 ( PEG)修饰壳聚糖膜 ,结果表明: PEG可改善壳聚糖的性能而不破坏壳聚糖良好的生物相容性。霍红光等 38, 39 研究了聚乙二醇改性壳聚糖( PEG2 CS) 固定化 L2 天门冬酰胺酶催化缓冲液中天冬酰胺的反应过程 ,结果表明:在适当的反应条件下 ,聚乙二醇改性壳聚糖固定化 L2 天门冬酰胺酶可以很好地水解缓冲液中的天冬酰胺。有报道 40, 41 用一种新型的交联剂 三羟甲基磷( THP)与壳聚糖胺基发生 Mannich 反应生成壳聚糖 2 THP,接着壳聚糖 2 THP 与 2 葡萄糖苷酶的胺基再一次发生 Mannich反应完
9、成固定化。交联反应在室温下自动进行 ,所形成的 P2CH2 2 N 键非常稳定 ,不被水解 ,可长期保存 42 。THP 是用四羟甲基氯化磷 ( THPC)加 KOH 反应得到的 ,而 THPC 是一种工业化大生产的阻燃剂 ,价格便宜 ,易于买到。卢大胜等 43 用这种新型的交联剂 三羟甲基磷 ( THP)和壳聚糖载体固定 2 葡萄糖苷酶 ,该固定化酶的酶活性 OD 值达到 0 . 229,酶活力回收率为 41 . 2% ,是采用戊二醛作为交联剂活性的 9倍 ,另外其酸碱稳定性、 耐有机溶剂性、 热稳定性及贮存稳定性与游离的酶和用戊二醛作交联剂固定的该酶相比有较大提高。彭立凤等 研究了壳聚糖涂
10、层在纤维素滤纸上成膜后再固定化猪胰脂肪酶的最佳条件。该方法反应条件温和 ,步骤少 ,简便易行 ,得到的固定化酶最适温度比游离酶提高了5 ,这对其催化油脂水解反应是非常有利的。3 JohnW, Sons I . I mmobilization of tryp sin on chitin and chitosan bys olid2state mix2 grinding J . Biotechnol bioeng, 1982 (62) : 753.4 李志国,欧伶,宋庆训.固定化脂肪酶的动力学研究 J .华东理工大学报, 2004, 30 (1) : 107110.5 Walt D R, Agay
11、n V I . The chemistry of enzyme and p rotein immobi2lizati on with glutaraldehyde J . Trends Anal . Chem. , 1994 ( 13 ) :425430.6 Kirkegy S, Jakobsen P, Moe D. Glutaraldehyde2 “pure and i mpure” :A s pectroscop ic investigati on of t wo commercial glutaraldehyde s olu2tions and their reacti on p rod
12、ucts with amino acids J . Anal Lett,1987 (20) : 303315.7 周纪宁, 江体乾 , 方波,等 . 甲醛活化壳聚糖制备固定化 L2 天冬酰胺酶 J . 功能高分子学报, 1998, 11 (4) : 534538.8 岳振峰,彭志英,张学兵. 壳聚糖固定化 2 葡萄糖苷酶的研究 J . 食品与发酵工业, 2001, 27 (4) : 2024.9 吴茜茜,吴克,刘斌,等. 壳聚糖固定化德氏根霉脂肪酶的研究 J . 工业微生物, 2003, 33 (4) : 913.10 蔡俊,邱雁临. 谷胱甘肽硫转移酶 ( GST) 的固定化及酶学特性研究 J
13、 . 生物技术, 2003, 13 (5) : 1112.11 王俊.以壳聚糖为载体固定化海藻糖合成酶 J . 化工进展 ,2004, 23 (10) : 1 1171 120.12 赵江,程彦伟,郭建林. 胃蛋白酶固定化条件的研究 J . 郑州工程学院学报, 2004, 25 (2) : 3436. 13 宋建彬,任孝修. 以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶的研究 J . 化工进展, 2004, 23 (2) : 181184.14 江龙法, 范莽, 桑占池. As1. 398 中性蛋白酶在球形壳聚糖上的固定化研究 J .淮海工学院学报, 2000, 9 (2) : 4749.15 黄雅钦,冷
14、延国,黄明智. AS1. 398 中性蛋白酶制备水解明胶 () 2 酶的固定化研究 J .化学工业与工程, 2001, 18 ( 2) : 7578.16 杨国营,郝振芳,秦玫.天然高分子材料壳聚糖固定化纤维素酶的研究 J . 河北师范大学学报, 2004, 28 (4) : 386389.17 刘晨光, 陈微, 孟祥红.三种形态的壳聚糖固定化脲酶的研究 J . 武汉大学学报, 2003, 49 (2) : 243246.18 郑迎迎,李大力. 壳聚糖载体的制备及脲酶的固定化研究 J .生物技术, 2005, 15 (2) : 5659.19 陈少欣,吴文琼,刘晨.三角酵母 D2 氨基酸氧化酶
15、的固定化研究 J . 中国医药工业杂志, 2003, 34 (2) : 6972.20 朱启忠,韩晓弟,赵洪.链霉菌 Strz2 2 胞外木聚糖酶的纯化和固定化研究 J . 生物技术, 2004, 14 (6) : 4850.21 李红, 王炜军, 徐凤彩 .壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的特性研究 J . 华南农业大学学报, 2001 , 22 (2) : 5860.22 姜梅,王善荣. 壳聚糖膜固定化葡萄糖氧化酶的研究 J . 食品工业科技, 2002, 23 (8) : 912.23 肖亚中,张书祥,胡乔彦.壳聚糖固定化真菌漆酶及其用于处理酚类污染物的研究 J .微生物学报, 2003, 4
16、3 (2) : 245250.24 陈盛,魏燕芳,蒋意娟. 壳聚糖固定化碱性脂肪酶的研究 J . 广州化学, 2003, 28 (3) : 2126.25 尹登科,丁虹,喻昕. 壳聚糖固定化谷胱甘肽硫转移酶的研究 J . 生物技术, 2004, 14 (6) : 1719. 26 吴定,邹耀洪,王云.固定化酶生产低聚异麦芽糖工艺研究 J .食品科学, 2005, 26 (3) : 125127.27 肖琳,龚加顺,姚建铭.单宁酶的固定化及性质研究 J . 中国医药工业, 2003, 34 (11) : 549552.28 夏文水,陈洁. 甲壳素和壳聚糖的化学改性及其应用 J . 无锡轻工业学院
17、学报, 1994, 13 (2) : 162171.29 魏荣卿,沈斌,刘晓宁.壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶 J .过程工程学报, 2005, 5 (2) : 183187.30 雷福厚. 壳聚糖铜固定化多酚氧化酶的研究 J . 林产化学与工业, 2000, 20 (2) : 2326.31 宋扬,侯司,赵辉.壳聚糖固定化酶一步纯化抑肽酶研究 J . 生物学, 2000, 17 (1) : 1821.32 肖厚荣,朱仁发,徐小龙.烟草多酚氧化酶固定化新工艺 J . 化工学, 2004, 55 (11) : 19211924.33 刘峥,蒋先民. 壳聚糖与丙烯腈接枝共聚物的制备及固定化淀粉酶研
18、究 J . 离子交换与吸附, 2001, 17 (3) : 256 262.34 袁春桃,蒋先明. 壳聚糖 2 g2 丙烯腈固定化木瓜蛋白酶的研究 J . 应用化学, 2002, 19 (9) : 863865.35 方波,宋道云,陈鸿雁.微球型壳聚糖胺基吸附剂的制备及性能 J . 化工科技, 2000, 8 (3) : 2023. 36 方波, 王任远, 宋道云.乙二胺羟丙基壳聚糖固定化天门冬酰胺酶的研究 J . 华东理工大学学报 (自然科学版 ) , 2001, 27(4) : 341343, 348.37 ZhangM, Li X H, Gong YD. Properties and b
19、iocompatibility of ch2itosan filmsmo2 dified by blendingwith PEG J . Bi omaterials, 2002(23) : 641648. (下转第 30 页 ) 38 霍红光,方波,江体乾. 聚乙二醇改性壳聚糖固定化 L2 天门冬酰胺酶的工艺研究 J . 华东理工大学学报, 2005, 31 (1) : 1317.39 霍红光,方波,江体乾. 聚乙二醇改性壳聚糖固定化 L2 天门冬酰胺酶反应性质研究 J . 华东理工大学学报, 2005, 31 ( 3 ) :277280.4 展望壳聚糖是自然界资源量仅次于纤维素的可再生资源 ,是自然界含有氨基和具有阳离子聚合物特征的多糖化合物 ,不仅有独特的理化性质和功能性质 ,还有生物活性、 生物相容性和可被生物降解性;该化合物中的羟基和氨基或乙酰氨基活泼 ,可以通过化学改性制备符合各种要求的衍生物 ,壳聚糖及其衍生物能作为载体 ,用吸附、 吸附交联、 凝胶包埋、 复合载体等方法对活性酶进行固定化 ,这种固定化酶具有活力高、 回收率高和耐贮藏等优势;此外 ,壳聚糖无毒无害无污染 ,更适合于食品中应用。因此 ,壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。
