1、几丁质酶和壳聚糖酶对部分乙酰化壳聚糖作用方式的比较作者：张 虎 杜昱光 虞星炬单位：中国科学院大连化学物理研究所 601 组 116023关键词：几丁质酶；壳聚糖酶；部分乙酰化壳聚糖几丁质酶和壳聚糖酶对部分乙酰化壳聚糖作用方式的比较 摘 要 通过对几丁质酶和壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的作用方式的比较，得到几丁质酶切断壳聚糖的 GlcNAc-GlcNAc 和 GlcNAc-GlcN 或 GlcN-GlcNAc 糖苷键，而壳聚糖酶切断壳聚糖的 GlcN-GlcN 和 GlcN-GlcNAc 或 GlcNAc-GlcN 糖苷键，为得到较高聚合度的壳寡糖提供理论基础。COMPARISON OF AC
2、TION PATTERN OF CHITINASE AND CHITOSANASEON PARTIALLY N-ACETYLATED CHITOSANHu Zhang Yuguang Du Xingju Yu. Department of Biochemical Engineering,Dalian Institute of Chemical Physics,Dalian,116023Abstract By Comparing the difference of the action pattern of chitinase and chitosanase on partially Nacet
3、ylated chitosan,the results were obtained that chitinase can not only cleave the GlcNAc-GlcNAc bond,but also cleave the GlcNAc-GlcN or GlcN-GlcNAc bond,while chitosanase can cut GlcN-GlcN and GlcNAc-GlcN or GlcN-GlcNAc bond of chitosan,which was the fundamental theory for the preparation of oligasac
4、charides with higher degree of polymerization.Key words Chitinase Chitosanase Patially N-acetylated Chitosan甲壳质(chitin)又名几丁质、壳多糖，在自然界中每年生成量约有 100 亿吨，产量仅次于纤维素，是自然界第二大类有机物质。由于甲壳质化学性质稳定，水溶性能差，所以应用受到限制。壳聚糖(chitosan)是甲壳质的衍生物，甲壳质经浓碱处理脱乙酰后产物，溶解性能较甲壳质有较大改进，因此壳聚糖的研究和应用引起国内外广泛关注，已经涉及到工业、农业、医学、食品、化妆品、重金属提取和回收、
5、有机物质分离和环境保护等众多行业和领域。壳聚糖是 2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(GlcN)单元的共聚体，通常它不是GlcN 的均匀共聚体，而是包含小于 40%N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)残基。壳聚糖有两个重要参数即分子量和乙酰化度(Da)，乙酰化度是指 GlcNAc 残基在壳聚糖分子中所含的摩尔分量。壳聚糖的乙酰化度一般为 5%30%，将壳聚糖进一步与乙酸酐反应可以提高其乙酰化度。壳聚糖的溶解性能随着乙酰化度的增加而降低，同时几丁质酶和壳聚糖酶在降解不同乙酰化度的壳聚糖时得到不同的产物。因此壳聚糖的乙酰化度对酶的作用有显著的影响。本文将综述几丁质酶和壳聚糖酶在作用不同酰化度的壳聚糖
6、时的作用方式的差别，进而利用两种酶的不同作用特点而得到较高聚合度的壳寡糖。1 几丁质酶降解部分乙酰化的壳聚糖几丁质酶(Chitinase,EC 3.2.1.14)是能够催化水解 N-乙酰-D-葡萄糖胺糖苷键的酶。它的作用底物为胶态几丁质，但是胶态几丁质制备方法繁琐，M.V.Tracey 将壳聚糖作为几丁质酶的可溶性底物，利用粘度测定方法测定几丁质酶的活性。Masaru Mitsutomi 等人发现几乎所有微生物产生的几丁质酶都能水解部分乙酰化的壳聚糖 1。图 1 表示几丁质酶降解部分乙酰化壳聚糖的示意图。随着壳聚糖乙酰化度的增加，酶反应速率也随着增加，酶切位点也相应增加。图 1 几丁质酶和壳聚
7、糖降解部分乙酰化壳聚糖的酶切示意图几丁质酶作用部分乙酰化壳聚糖的产物经过减压浓缩后，用柱色谱(如Sephadex)洗脱后，将活脱液浓缩干燥并采用 -GlcNase 和 -GlcNAcase 两种酶作用上述产物，从而鉴定出产物还原端的组成和产物的序列，同时可以利用亚硝酸降解含有 GlcN 残基不降解含有 GlcNAc 残基的寡糖进一步确认产物的组成。表 1 表示几丁质酶降解部分乙酰化壳聚糖的降解产物。表 1 几丁质酶降解部分乙酰化壳聚糖所得寡糖Aeromonal hydrophilaStreptomyces griseusBacillus circulans WL-12 chitinase A1
8、Bacillus circulans WL-12 chitinase DAeromonas sp.No.10S-24Pycnoporus cinnabarinusTrichoderma reeseiStreptomyces griseus HUT 6037从上表知道，Aeromonas sp.No.10S-24 菌株产生的几丁质酶在降解部分乙酰化壳聚糖时，水解壳聚糖的 GlcNAc-GlcNAc 和 GlcNAc-GlcN 两种糖苷键 2。这种酶切作用与从 Aeromonas hydrophila,Streptomyces grieus 和 Bacilllus circuluns WL-12
9、产生的几丁质酶作用方式类似。但是 S.griseus HUT6037 产生的几丁质酶切断 GlcNAc-GlcNAc 和 GlcN-GlcNAc 糖苷键 3，这与植物(如大白菜)中的几丁质酶作用方式类似。这些结果表明几丁质酶作用壳聚糖时至少需要在水解的糖苷键一侧有一个 GlcNAc 基团。2 壳聚糖酶作用部分乙酰化壳聚糖在 1984 年国际酶学命名会议上，壳聚糖酶还没系统命名。Monaghan 在研究细菌和真菌过程中，首先提出壳聚糖酶(Chitosanase,EC 3.2.1.99)是一种不同于几丁质酶的酶 4，随后相继从许多微生物和植物中分离、纯化出具有种属特异性的壳聚糖酶，壳聚糖被认为是对
10、线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。壳聚糖酶降解壳聚糖时切断的糖苷键位点见图 1。壳聚糖酶在降解部分乙酰化壳聚糖时，可以得到壳寡糖和杂寡糖，对这些寡糖按照上述几丁质酶得到寡糖的分析方法进行分析，可以得到表 2。表 2 壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖所得的寡糖Penicillium IslandicumBacillus pumilus BN-262Steptomyces sp.N174Bacillus sp.No.7-Mstreptomyces griseus HUT 6037Bacillus circulans MH-K1(表中的百分比为非均相制备的壳聚糖的乙酰化程度，其它符号意义同表1。)从上
11、表知道，Bacillus sp.NO.7-M 产生的壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖后，寡糖的还原端和非还原端都含有 GlcN 基团，说明壳聚糖只能特异性切断壳聚糖的 GlcN-GlcN 糖苷键 5；而 S.griseus HUT6037 和 B.circulans MH-k1 产生的壳聚糖酶不仅切断壳聚糖的 GlcN-GlcN 糖苷键，而且切断 GlcN-GlcNAc 糖苷键，因此得到的寡糖还原端末端只有 GlcN 基团 6,2；另外 Bacillus pumilus BN-262 和 Streptomyces sp.N174 产生的壳聚糖酶降解后得到的寡糖的还原端含有 GlcNAc 或者 Gl
12、cN 基团和非还原端含有 GlcN 基团，表明这些壳聚糖酶切断壳聚糖的 GlcNAc-GlcN 和 GlcN-GlcN 糖苷键 7，8 。Fenton 和 Eveleigh 已经报道 Penicillium islandium 产生的壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖后得到的寡糖的还原端只有 GlcNAc 基团 9。从以上比较知道，几丁质酶和壳聚糖酶在降解部分乙酰化壳聚糖时，并不只是严格切断 GlcNAc-GlcNAc 和 GlcN-GlcN 糖苷键，但是几丁质酶可以认为是一种催化水解至少含有一个 GlcNAc 基团的糖苷键，而壳聚糖酶则是催化水解至少需要一个 GlcN 基团的糖苷键。低分子量的壳聚
13、糖即壳寡糖水溶性能好，具有一般功能性寡糖的共同特点外，还具有抗肿瘤和抑制肿瘤转移的生理功能以及增强机体免疫力的作用。另外壳寡糖还可作为植物功能调节剂，调节植物抗病基因的表达，激活植物的防御反应。但是壳寡糖的上述功能是与其聚合度有密切关系，实验结果表明聚合度为 510 的壳寡糖才具有上述功能，而低聚合度(14)的寡糖却没有上述功能 10-12。高聚合度的壳寡糖通过化学降解、酶法降解和合成方法可以得到，但是目前研究主要集中在酶法降解部分乙酰化的壳聚糖后得到。通过对上述几丁质酶和壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的讨论，可以得到以下结论：1.必须首先通过实验阐明不同菌株产生的几丁质酶和壳聚糖酶对部分乙酰化
14、壳聚糖的不同作用方式；2.几丁质酶降解部分乙酰化的壳聚糖时，因为几丁质酶不仅切断GlcNAc-GlcNAc 糖苷键，而且可以切断 GlkcNAc-GlcN 或 GlcN-GlcNAc，所以降解产物寡糖的组成与壳聚糖的乙酰化度有关系，并且随着乙酰度增加，降解速率而增加；3.壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖时，得到的寡糖不仅与壳聚糖的乙酰化度有密切关系，而且与壳聚糖酶本身的性质有关系。对于只切断 GlcN-GlcN 的糖苷键的壳聚糖酶，壳聚糖的乙酰化度高，可以得到较高聚合度的壳寡糖，但是水解速率慢；乙酰化度低，容易得到聚合度非常小的寡糖。参考文献1 ohtakara A,Izume M and Mit
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