1、北方民族大学实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物工程实验题目：果酒酵母发酵班级：生物工程 101姓名：0000学号：20103374四组成员：果酒酵母发酵选取 1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。一、实验目的和内容1掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能） 。2用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精）。二、实验原理 果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生
2、成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。三、实验仪器与材料样品：新鲜水果及压榨汁。试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%
3、HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土 (有机物含量少的黄土)或者红土；器皿：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL) 、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.51.2 cm ）冰箱，低温冰箱（-30 ） ，液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W） ，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。四、实验方法与步骤1自选酵母发酵性性能的检测试验：用筛选菌种发酵果酒（1）果酒酿造的工艺流程 鲜果分选破碎、除梗果浆分离取汁澄清清汁 发酵倒桶贮酒过滤冷处理调配过滤成品 （2）
4、工艺简述 1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。破碎、除梗： 破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。二氧化硫处理： 二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为 60-100mg/L。 （以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：葡萄果实70%60/0.061000。
5、 ）此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加 。2）果汁的调整： 取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。糖的调整： 酿造酒精含量为 10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。酸的调整： 酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在 0.6%-0.8%，甜酒 0.8
6、%-1%一般 pH 大于 3.6 或可滴定酸低于 0.65%时应该对果汁加酸。 3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在 20-28 ，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为 3-12 天。残糖降为 0.4%以下时主发酵结束。糖度的测定：费林试剂比色法试剂：费林甲液：称取 68.29g 硫酸铜（CuSO45H2O） ，溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。费林乙液：称取 346g 酒石酸钾钠及 100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到 1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶
7、中。0.25葡萄糖标准溶液：准确称取 2.500g 经 98-105干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入 1000ml 容量瓶中，加入 5ml 浓 HCl（防止微生物生长） ，用蒸馏水稀释到 1000ml。2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml 锥形瓶，滴定管。操作步骤 ：1）标定预备试验：吸取费林溶液 A、B 各 5.00 mL 于 250 mL 三角瓶中，加 50 mL 水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加 2 滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。2）标定正式试验：戏取费林溶液 A
8、、B 各 5.00 mL 于 250 mL 三角瓶中，加 50 mL 水和比预备试验少 1 mL 的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。计算式中： F费林溶液 A、B 各 5 mL 相当于葡萄糖的克数，g；m 称取葡萄糖的质量，g；V消耗葡萄糖标准溶液的总体积， mL。3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1 ）于 100 mL 容量瓶中，使之所含还原糖量为 0.20.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B 各 5.00 mL 于 250 mL 三角瓶中，
9、加 50 mL 水和一定量的试样（试样所含还原糖量为 0.2-0.4g） ，加热至沸，并保持 2 min，加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（4）计算。4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1 ）于 100mL 容量瓶中，使之所含总糖量为 0.20.4 g，加 5 mL 盐酸溶液，加水至 20 mL，摇匀。于 681水浴上水解 15 min，取出，冷却。用 200 gL 氢氧化钠溶液中和至中性， （加入 2 滴酚酞，用 NaOH 溶液滴定至微红色） 。调温至 20，加水定容至刻度（V2） 。吸取费林
10、溶液 A、B 各 5.00 mL 于 250 mL 三角瓶中，加 50 mL 水和一定量的试样（试样所含总糖量为 0.2-0.4g） ，加热至沸，并保持 2 min，加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。式中：X总糖或还原糖的含量，gL；F 费林溶液、各 5 mL 相当于葡萄糖的克数，g；V1吸取的样品体积，mL；V2 样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3消耗试样的体积，mL； G葡萄糖标准溶液的准确浓度，gmL；V消耗葡萄糖标准溶液的体积， mL。所得结果应表示至一位小数。酸度的测定：中和滴定法试剂
11、酚酞指示剂溶液，10g/L ：称取酚酞 1.0g，溶于 60mL 乙醇中，用水稀释至 100mL。0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)0.1mol/L。1）配制 将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。 2）标定 称取0.6 g于105110 烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001 g。溶于50 mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。 3）计算 按下式计算
12、氢氧化钠标准溶液的浓度：C m/(V1-V2) 0.2042 式中：C 氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； m 基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V 滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积， mL；V1 空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042与1.00mL氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。 操作步骤1）样品的测定 取调温至20 的样品2.00-5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)0.1mol/L）滴定
13、至溶液微红色为终点，并保持30s 内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积 V1。 起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。 2）空白的测定吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。3）结果计算 按下式计算滴定酸的量，以g/L表示： 式中：X 样品中滴定酸的含量，g/L；c 氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1 样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0 空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； V2 吸取样品的体积，mL； Si 与1.00mL氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的，以克表示的
14、试样主体酸的质量。 S酒石酸0.075；S 苹果酸 0.067；S柠檬酸0.064；S草酸 0.045酒度的测定：蒸馏法材料 全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。操作步骤1）用一洁净、干燥的 100 mL 容量瓶准确量取 100 mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温 20）于 500 mL 蒸馏瓶中，用 50 蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约 100 毫升时，用蒸馏水定容至 100mL2）将试样倒入洁净、干燥的 100 mL 量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡 5 min，
15、水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成 20时酒精度。所得结果表示至一位小数结果分析一）主发酵各时期的特征：（1）发酵初期, 主要是酵母菌的繁殖阶段特征: 液面平静 气泡产生 品温渐高 甜味尚浓 比重较大 酒味产生（2）发酵中期，主要是酒精发酵阶段特征: 气泡剧增 液面沸腾 酒帽浮起品温高升 甜味渐淡 酒味渐浓（3）发酵末期特征: 气少液平 品温渐低 甜味极淡酒味最浓 浮渣下沉 酒液变清二）糖度随时间的变化天数 1 2 3 4 5 6 7 8 9糖度/l160 125 83.5 53.1 34.5 24.6 15.2 10.3 6.5果
16、浆中含糖量随时间的变化曲线三）酸度随时间的变化天数 1 2 3 4 5 6 7酸度/l1.875 3.75 4.5 4.5 4.6 5.15 6.15四）酒精度通过蒸馏法测得酒精度为8.。结论通过实验得出影响酵母生长和发酵的主要因素1.温度：最适生长温度2528 ；1314 发酵起动困难，随温度升高发酵加快，35 酵母衰老快2.压力：0.8MPa停止酵母的生长繁殖，1.4MPaAF（酒精发酵 :酵母菌将葡萄浆果中的糖分解为酒精、 二氧化碳和其它副产物，这一过程称为AF）停止。用外加0.8MPa CO2防止酵母生长繁殖。3.酸度：pH 3.33.54.糖：12%发酵速度最快，5%开始有抑制作用，25% 发酵延滞，70%大多数酵母不能生长和发酵。 5.SO2：添加10mg/L 可看出对 AF的延迟作用，1.21.5 g/L能杀死酵母等微生物，保存葡萄汁6.发酵代谢产物：酒精和CO2 是主要代谢产物，对AF有抑制作用。中间产物脂肪酸对AF也有抑制作用误差分析1.在榨果汁期间没有及时加入亚硫酸，是果汁变色。2.向果浆中加入安琪酵母时，没有将酵母完全活化。3.测糖测酸的途中，没有控制好滴定终点，使测量不准确。
