1、实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验原理 （供参考，试剂盒的 Solution SS 成分未知） 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的 DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的羟基 钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42短时间热处理（热休克） ，可以促进细胞吸收 DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如 Amp 抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37 培
2、养过夜，这样即可得到转化菌落。 仪器、材料与试剂 (一)仪器1小型高速离心机2恒温摇床3恒温箱420冰箱5恒温水浴器 (二)材料1氨苄青霉素2大肠杆菌 DH5a3pUC1941.5mL 离心管5枪头、枪6试管、培养皿 (三)试剂1快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2LB 培养液在950mL 去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g 酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用 Na0H 调节 pH 至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121 湿热灭菌 20min。 3氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mgmL
3、 溶液，置20冰箱保存。 实验步骤 1从大肠杆菌 DH5a 平板上挑取一个单菌落接于2mL LB 培养液的试管中，37振荡培养过夜。 2取50mL 菌液转接到一个含有 5mL LB 培养液锥形瓶中， 37振荡培养2小时。 以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3用灭菌的枪头取0.5mL 的大肠杆菌培养物于1.5mL 灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL 预冷的 Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL 的取液器设定在500mL 。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4将上述细胞分装于1.5mL 离心管 (离心管要在放在冰上预冷 ) 中，每管0.1m
4、L。细胞可以立即使用或储存。 5将感受态细胞迅速转移到20或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1新鲜制备的或20下保存的100mL 感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2加入5mL pUC19 质粒，DNA 浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3冰上放置30分钟。 442水浴热激60秒。 5冰上放置2分钟。 6加400mL LB 培养液，37 250转分振荡培养30分钟。 7室温下4000rpm 离心5分钟，用枪头吸掉400mL 上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮
5、。 8将细菌涂布在 Amp/LB 琼脂平板上。 9平皿在37下正向放置 1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。 实验结果 经 37培养过夜的、在氨苄青霉素/LB 琼脂平板上出现的菌落即为 pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每 mg 质粒 DNA 转化的菌落数表示。实验二 质粒 DNA 的提取 实验原理 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒 DNA 与线状的染色体DNA 片段在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线状的 DNA 双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键虽
6、然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入 pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使 pH 降低后，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS 复合物等一起沉淀下来，而质粒 DNA 却留在上清液中。 仪器、材料与试剂 (一)仪器1恒温培养箱2恒温摇床3小型高速离心机4高压灭菌锅 (二)材料1带有 pQE31质粒和 pUC18CAT 质粒的两株大肠杆菌21.5mL 离心管3枪头、枪 (三)试剂质粒小量制备试剂盒(3
7、S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司) 试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1L 葡萄糖，5mmo1L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)TrisHCl(pH8.0)，1.0 mmo1L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1L Na0H，2SDS( 十二烷基硫酸钠) ，用前等体积混合 Solution II I5mo1L 醋酸钾，60 mL 冰乙酸 11.5mL 水，28.5mL TE 缓冲液，10mmo1L TrisHCl1mmo1L EDTA(pH8.0)，胰 RNA 酶 (RNA 酶 A)，将 RN
8、A 酶溶于10mmo1L TrisHCl(pH7.5)、15mmo1 L NaCl 中，配成10 mgmL 的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于 20。 实验步骤 (一)提取质粒将 3mL 含 Apm 的 LB 液体培养基加入到两支试管中，分别接入含 pQE31质粒和 pUC18CAT 的大肠杆菌， 37振荡培养过夜。以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳 将5mL 洗脱液与3mL 的 DNA 样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。 附：试剂盒说明书 3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3
9、1上海申能博彩生物科技有限公司bbst shl63net 试剂盒组成： 组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次） Solution I(a) 5m1 10m1 25m1 Solution II(b) 10m1 20m1 50ml Solution lll 20m1 50m1 2x50m1 Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1 TE(d) 5m1 10m1 40m1 3S Column 50支 100支 250支 Co11ection tube 50支 100支 250根 说明书 1份 1份 l 份 注： a)Solutio
10、n I 内含 RNaseA，每次实验结束后，4 保存。 b)温度低时，Soluion II 有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。 c)首次使用前，必须在 Wash Solution 瓶中加入50ml 无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持 Wash Solution 中的乙醇含量。 d)TE pH80或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱 DNA，效率通常要低 些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。 主要特点： 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需 CsCl 离心。 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于
11、 DNA 全白动荧光测序。 实验操作步骤(从细菌中抽提质粒) 1将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。 2加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml 细胞，无需提高 SolutionI，II 和 III 的用量。 3加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。 4加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5 10次，使之充分中和，室温放置2分钟。注意：步骤2
12、和3在冰上操作效果更佳。 5高速离心，15，000转分钟，10分钟。无需低温离心。注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。 6取出2m1样品收集管和3S 柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S 柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12 ，000转分钟)离心1分钟。注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现 Genomic DNA 和蛋白质污染。离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正
13、常现象。 7取下3S 柱，弃去掉收集管中的废液，将3S 柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution 到3S 柱，离心 1分钟。 8重复步骤7一次。 9取下3S 柱，弃去掉收集管中的废液，将3S 柱放入同 支收集管中，高速离心2分钟。 10将3S 柱放入干净的15m1的离心管中，在3S 柱子膜中央加 50ml TE 或水，不要盖上离心管盖 , 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。注意：将 TE 或水预热到50 左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml 预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。 11洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或20保存备用。lml
14、过夜培养细胞，质粒如果用50ml 水洗脱，通常情况下可以取 10ml洗实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的 DNA 片段迁移速度不一样， 迁移速度与 DNA 分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的 DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的 DNA 分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭
15、合环状 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)，开环 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状质粒 DNA， 即质粒 DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称 LDNA)。由于这3种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 仪器、材料与试剂(一)仪器1恒温培养箱2琼脂糖凝胶电泳系统3小型高速离心机4高压灭菌锅5紫外核酸检测仪
16、(二)材料1pQE 31和 pUC18CAT 质粒(三) 试剂150xTAE(50倍体积的 TAE贮存液) 配1000mL 50xTAE：Tris 242 g 冰醋酸 57 mL0.5molL EDTA 200 mLpH 8.02凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝 0.25蔗糖 403琼脂糖 4溴化乙锭溶液(EB) 0.5gmL 5250bp DNA 分子量标准 实验步骤(一)制备琼脂糖凝胶根据被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性 DNA 的有效分离范围 kb0.3 5600.6 120O.7 0.810O.9 0.571.2 0.461.5 0.2
17、42.0 0.13 实验用1.2琼脂糖。称取1.2g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。 (二)胶板的制备 1取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。 2将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 4待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA 样品孔应朝向负电极一端。 5加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面11.
18、5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。( 四 )电泳 1接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA 的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm 。 2当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1 2cm 处，停止电泳。(五) 染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE 缓冲液中加两滴2mg/mL 的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色2030分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。 实验结果 在紫外灯 (360nm 或254nm) 下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色
19、荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。 脱液做 Agarose 电泳或酶切分析。实验四 DNA 重组 实验原理DNA 重组是将外源 DNA 与载体分子连接，这样重新组合的 DNA 叫做重组体或重组子。DNA 重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。常用的 DNA 连接酶是 T4噬菌体 DNA 连接酶，它不但能使粘性末端的 DNA 分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA 分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效
20、率低，一般可通过提高 T4噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。连接反应的温度在37 时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在1216，反应12 16小时(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 仪器、材料与试剂(一)仪器1恒
21、温摇床2恒温水浴3恒温培养箱4小型高速离心机(二)材料1 氨苄青霉素2 BamHI3 HindIII4 T4 DNA 连接酶 5 pQE31 和 pUC18CAT 质粒6 培养皿7 接种针8 金属涂棒 9 1.5mL 离心管 10酒精灯11镊子、灭菌牙签等( 三) 试剂 DNA 琼脂糖胶纯化试剂盒（ 3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司） 实验步骤 (一)质粒 DNA 用实验二提取的 pQE31和 pUC18CAT 质粒。(二)制备重组 DNA1在灭菌的1.5mL 离心管中，加入 pQE31质粒10mL(2mgmL)，2mL 酶切缓冲液
22、，1mL BamHI 和 HindIII 酶 的混合液（各含 10个单位） ，无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL ，离心混匀，37反应过夜。2在另一无菌1.5mL 离心管中，加 pUC18CAT 质粒20mL ，加入3mL 酶切反应液，lmL BamHI 和 HindIII 酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37反应过夜。3 反应完毕后取5mL pQE31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。4将酶切处理的后 pQE31和 pUC18CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加 DNA 分子量标准） 。电泳结束后用 DNA 琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒
23、说明书的方法回收 DNA 片段。前者回收的片段为 3.5kb，后者为650bp。5将回收的 pQE31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的 CAT 片段混合，做连接；另一份不加 CAT 片段，做对照。操作如下：在10mL DNA 样品中, 加 T4 DNA 连接酶缓冲液1mL，T4 DNA 连接酶1mL，14（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。(三)转化感受态细胞1用实验一制备的感受态细胞(20保存的)。2在100mL 的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL 连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加 CAT片段的空白 pQE31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。 实验结果 过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的 DNA 重组子还须进一步鉴定。
