1、拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1 研究方案（本项目涉及的所有研究方法在扬州大学相关国家重点学科实验室均可以实施）3.1 研究方案（本项目涉及的所有研究方法在扬州大学相关国家重点学科实验室均可以实施）1)分离、纯化、培养、鉴定 1)分离、纯化、培养、鉴定 a) Ficoll 密度梯度离心法分离 MSCs，心肌内注射氯胺酮（20mg/kg 或 1000 mg IM）和乙酰普吗嗪（0.2 mg/kg）进行全麻。一） 聚蔗糖密度梯度离心法分离 MSCs，心肌内注射氯
2、胺酮（ 20 毫克公斤或 1000 毫克 IM）和乙酰普吗嗪（ 0.2 毫克公斤）进行全麻。thiopental 硫喷妥钠(10 mL of 5% IV ).从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，腹侧卧位后足挤进身体下面，髂嵴部位消毒。戊硫代巴比妥硫喷妥钠 （ 10 毫升 5%4 ）.从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，腹侧卧位后足挤进身体下面，髂嵴部位消毒。抽吸约 14 mL 骨髓进含有 6000 单位肝素的灌注器，肌肉注射 0.3 的吗啡镇痛。.抽吸约 14 毫升骨髓进含有 6000 单位肝素的灌注器，肌肉注射 0.3 的吗啡镇痛。 。通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，去除大部分红细胞、脂肪细胞和血小板，获得
3、纯度较高的单个核细胞。通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，去除大部分红细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。提取单个核细胞层细胞培养 24h 待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液与传代去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，MSCs 逐渐得到进一步纯化。提?龊讼赴 阆赴 嘌?4 h 待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液与传代去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞， MSCs 逐渐得到进一步纯化。采用流式细胞仪检测表面抗原、免疫组化染色等进行鉴定，标记后加入地塞米松、维生素 C、细胞因子等诱导培养液，倒置相差显微镜和 HE 染色观察细胞形态，调
4、整细胞浓度，精确计数待回输。采用流式细胞仪检测表面抗原、免疫组化染色等进行鉴定，标记后加入地塞米松、维生素 C，细胞因子等诱导培养液，倒置相差显微镜和他染色观察细胞形态，调整细胞浓度，精确计数待回输。b) 采用免疫荧光激活细胞分选（FACS）方法分离 VSEL-SCs，从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，从 GFP 标记的猪髂骨或胸骨中提取骨髓，红色的血细胞在 0.9%的 NH4Cl 溶液中溶解掉。b） 采用免疫荧光激活细胞分选（FACS）方法分离 VSELSCs，从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，从 GFP 标记的猪髂骨或胸骨中提取骨髓，红色的血细胞在 0.9% 的 NH4 Cl 溶液中溶解掉。分离的骨髓细胞
5、再次悬浮在包含 1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(FBS; HyClone, Logan, UT, http:/)中。分离的骨髓细胞再次悬浮在包含 1% 胎牛血清的磷酸盐缓冲液（ FBS； HyClone 、摇石、 UT， http:/) 中。以下主要的抗体同时加入: biotin-conjugated monoclonal rat antimouse Ly-6A/E (Sca-1) (clone E13-161.7), APC-Cy7-conjugated monoclonal rat antimouse CD45 (clone 30-F11) and phycoery-thrin (PE) co
6、njugated monoclonal rat antimouse lineage markersanti-CD45R/ B220 (PE; clone RA3-6B2), anti-Gr-1 (PE; clone RB6-8C5), anti-TCR (PE; clone H57-597), anti-TCR (PE; clone GL3), anti-CD11b(PE; clone M1/70), anti-Ter119 (PE; clone TER-119).第二次用 PE-Cy5-conjugated streptavidin 染色。以下主要的抗体同时加入： 生物素结合的单细胞繁殖的鼠
7、 antimouse Ly-6 AE（ Sca-1)(同本生物 E13-161.7), APCCy7-结合的单细胞繁殖的鼠 antimouse CD45(同本生物 30-F11) 和 phycoerythrin（PE）结合的单细胞繁殖的鼠 antimouse 谱系标记反 CD45 RB 220(PE；同本生物 RA3-6 B2) 、反 Gr-1(PE；同本生物 RB6-8 C5), 反 TCR(PE；同本生物 H 57-597), 反 TCR,(PE；同本生物 GL 3) 反激光唱碟 11 b（PE；同本生物 M 1/70), 反 Ter 119(PE；复制 TER-119).第二次用 PEC
8、y5- 结合的 streptavidin 染色。所有的试剂购买于 BD Pharmingen(San Jose, CA, http:/ 4C 环境中染色 20 分钟。所有的试剂购买于 BD Pharmingen（桑河 Jose 、加州， http:/ 4 C 环境中染色 20 分钟。染色后在包含 1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中冲洗。染色后在包含 1% 胎牛血清的磷酸盐缓冲液中冲洗。根据下图的线路图流式细胞仪分离细胞。根据下图的线路图流式细胞仪分离细胞。大部分分离的细胞收集在 2ml 的含 10胎牛血清的 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM： 改进的 ea
9、gle 培养基)中。大部分分离的细胞收集在 2 毫升的含 10胎牛血清的 Dulbecco 已经修正伊格尔培养基 （DMEM：改进的鹰培养基）中。分离细胞后立即分析细胞的纯度。分离细胞后立即分析细胞的纯度。分选的细胞生存力超过 90%。分选的细胞生存力超过 90%。分选的细胞通过离心沉淀压片在 1000 克 10 分钟，再次悬浮在含 10胎牛血清的DMEM 培养基中，且容积更小的等比例的细胞数量。分?南赴 胄某恋硌蛊 ?000 克 10 分钟，再次悬浮在含 10胎牛血清的 DMEM 培养基中，且容积更?牡缺壤 南赴 俊细胞分装在 50 微升容积内用于心内注射。细胞分装在 50 微升容积内用于心
10、内注射。在包含低浓缩胎牛血清的 DMEM 培养基中，EGFP 标记的 VSEL-SCs 平铺在未标记的C2C12 细胞滋养层上。在包含低浓缩胎牛血清的 DMEM 培养基中， EGFP 标记的 VSELSCs 的平铺在未标记的 C2C 12 细胞滋养层上。VSEL-SCs 扩增持续 9 天，每 3-4 天更换培养基。VSELSCs 的扩增持续 9 天，每 3-4 天更换培养基。扩增后，所有细胞受胰蛋白酶作用，流式细胞仪将 EGFP 标记的扩增的 VSEL-SCs和 C2C12 细胞分离开。扩增后，所有细胞受胰蛋白酶作用，流式细胞仪将 EGFP 标记的扩增 VSELSCs 的和 C2C 12 细胞
11、分离开。100,000 cells 的 50 微升体积（鼠）在类似的培养基中培养 5 天，以供注射入心肌。100,000 细胞的 50 微升体积（鼠）在类似的培养基中培养 5 天，以供注射入心肌。因为有报道称：梗死心肌中的趋化物表达在再灌注后的 48 小时达最大化 ，所以我们选择这个时间点进行移植。因为有报道称：梗死心肌中的趋化物表达在再灌注后的 48 小时达最大化，所以我们选择这个时间点进行移植。经红细胞裂解液冲洗，经 FACS 分选 VSEL-SCs，用流式细胞仪检测 VSEL-SCs 的表面标记物，RT-PCR、透射电子显微镜、倒置相差显微镜等鉴定。经红细胞裂解液冲洗，经 FACS 分选
12、 VSELSCs，用流式细胞仪检测 VSELSCs 的表面标记物， RTPCR 、透射电子显微镜，倒置相差显微镜等鉴定。标记后加入地塞米松、维生素 C、细胞因子等诱导培养液，台盼兰染色检测细胞活力，调整细胞浓度，精确计数待回输。标记后加入地塞米松、维生素 C，细胞因子等诱导培养液，台盼兰染色检测细胞活力，调整细胞浓度，精确计数待回输。2）MSCs 和 VSEL-SCs 的标记 首次移植的 NHSCs 采用 Brdu 标记，将经胰酶消化的细胞，离心后接种于培养液中，加入 Brdu 标记物。2）MSCs 和 VSELSCs 的标记首次移植的 NHSCs 采用 Brdu 标记，将经胰酶消化的细胞，离
13、心后接种于培养液中，加入 Brdu 标记物。再次移植的 NHSCs 采用 RFP 标记。再次移植的 NHSCs 采用 RFP 标记。3）建立猪 AMI 模型及 NHSCs 移植3）建立猪 AMI 模型及 NHSCs 移植a) 首先予初步吸入麻醉，将实验猪固定于心脏导管室手术台上，胸部备皮；气管插管，连接呼吸机；b) 开放耳缘静脉，以 5%葡萄糖水静滴维持通道，心肌内注射氯胺酮（20mg/kg 或 1000mg 肌注） 和乙酰普吗嗪（0.2 mg/kg）进行全麻。一） 首先予初步吸入麻醉，将实验猪固定于心脏导管室手术台上，胸部备皮；气管插管，连接呼吸机； b）开放耳缘静脉，以 5% 葡萄糖水静滴
14、维持通道，心肌内注射氯胺酮（ 20 毫克公斤或 1000 毫克肌注）和乙酰普吗嗪（ 0.2 毫克公斤）进行全麻。1戊巴比妥钠溶液以 2ml/kg(30 mg/kg IV)耳缘静脉麻醉，碘伏消毒铺巾，心电监护；c) 一根 2.0*10 mm 的球囊 通过 8F 的鞘从左颈动脉进入左前降支刚好在第二最大的对角线支的远端。2 毫升公斤 （30 毫克公斤 4） 1 戊巴比妥钠溶液以耳缘静脉麻醉，碘伏消毒铺巾，心电监护； c）一根 2.0*10 毫米的球囊通过 8F 的鞘从左颈动脉进入左前降支刚好在第二最大的对角线支的远端。球囊在最低大气压下膨胀完全封堵约 60 分钟。球囊在最低大气压下膨胀完全封堵约
15、60 分钟。球囊放气后，血管造影证明封堵成功。球囊放气后，血管造影证明封堵成功。在球囊封堵前静脉注射 50mg 利多卡因， 注射 25mg 在放气前，另外在发现有严重室速时可注射 25mg 利多卡因。在球囊封堵前静脉注射 50 毫克利多卡因，注射 25 毫克在放气前，另外在发现有严重室速时可注射 25 毫克利多卡因。按照标准方法 sedingler 法穿刺猪股动脉，予肝素 8000 （300 IU/千克）单位后进行冠状动脉造影，插入球囊导管封堵猪冠状动脉左前降支第一对角支分叉处制备大面积前壁心肌梗死模型，封堵时间压力均相同以确保梗死面积同质化；d) 当心电图示胸前至少相邻 4 个导联 ST 段
16、明显持续上抬，提示 AMI 造模成功。按照标准方法 sedingler 法穿刺猪股动脉，予肝素 8000（300 IU千克）单位后进行冠状动脉造影，插入球囊导管封堵猪冠状动脉左前降支第一对角支分叉处制备大面积前壁心肌梗死模型，封堵时间压力均相同以确保梗死面积同质化； d）当心电图示胸前至少相邻 4 个导联圣段明显持续上抬，提示 AMI 造模成功。经历过 MI 后存活一周且一般情况稳定，LVEF 较术前下降 5%以上的猪，采用随机表法，分配到以下八组（n=8,每组）：单次 VSEL-SCs、MSCs （2 mL, 1.0 108cells）移植组分别在 LAD 中远端注入 VSEL-SCs、MS
17、Cs 悬液 15ml，重复 VSEL-SCs、MSCs 移植组分别共注入 30ml 等浓度的 VSEL-SCs、MSCs 悬液；单次 VSEL-SCs、MSCs 移植2 倍量组一次分别注入 30ml 等浓度 VSEL-SCs、MSCs 悬液；单次移植对照组则以同法注入 1 倍量的培养基；重复移植对照组共注入 2 倍量的培养基。经历过 MI 后存活一周且一般情况稳定，LVEF 较术前下降 5%以上的猪，采用随机表法，分配到以下八组（n=8,每组）：单次 VSEL-SCs、MSCs （2 mL, 1.0 108cells）移植组分别在 LAD 中远端注入 VSEL-SCs、MSCs 悬液 15ml
18、，重复 VSEL-SCs、MSCs 移植组分别共注入 30ml 等浓度的 VSEL-SCs、MSCs 悬液；单次 VSEL-SCs、MSCs 移植2 倍量组一次分别注入 30ml 等浓度 VSEL-SCs、MSCs 悬液；单次移植对照组则以同法注入 1 倍量的培养基；重复移植对照组共注入 2 倍量的培养基。另设非梗死模型阴性对照组；f) 术后继续监护 24 小时，待猪各方面情况恢复后送回动物房，青霉素肌注 3 天预防感染。另设非梗死模型阴性对照组；f) 术后继续监护 24 小时，待猪各方面情况恢复后送回动物房，青霉素肌注 3 天预防感染。4）SDF-1、FGF 、HGF、IGF-1、VEGF
19、等因子检测 a) RT-PCR 检测：分别检测血浆和心肌中 SDF-1、FGF、HGF、IGF-1、VEGF mRNA 的表达。4）SDF-1 、 FGF 、 HGF 、 IGF-1,VEGF 等因子检测一） RTPCR 的检测：分别检测血浆和心肌中 SDF-1 、 FGF 、 HGF 、 IGF-1,VEGF mRNA 的表达。取各组标本制成匀浆，提取总 RNA，逆转录 cDNA。取各组标本制成匀浆，提取总 RNA，逆转录 cDNA。然后进行 PCR 扩增。然后进行 PCR 扩增。b)Western blotting 检测：分别检测血浆和心肌中 SDF-1、FGF、HGF、IGF-1、VEG
20、F蛋白的表达。b）西方污点检测：分别检测血浆和心肌中 SDF-1 、 FGF 、 HGF 、 IGF-1,VEGF 蛋白的表达。取各组标本加入 100L 组织裂解液和 3L 蛋白酶抑制剂制成匀浆，提取蛋白并检测蛋白浓度。取各组标本加入 100 L 组织裂解液和 3 L 蛋白酶抑制剂制成匀浆，提?鞍撞觳獾鞍着 取采用对骨髓核细胞趋化法检测 SDF-1 梯度。采用对骨髓核细胞趋化法检测 SDF-1 梯度。5)超声心动图评估心功能 分别于造模前后、VSEL-SCs、MSCs 移植后 3 及 6 个月，以VIVID7 心脏彩色多普勒超声仪在左室长轴切面和 M 超下检测猪心功能变化，包括LVEF，左室缩
21、短分数，左室舒张末期内径以及左心室室壁运动。5)超声心动图评估心功能 分别于造模前后、VSEL-SCs、MSCs 移植后 3 及 6 个月，以VIVID7 心脏彩色多普勒超声仪在左室长轴切面和 M 超下检测猪心功能变化，包括LVEF，左室缩短分数，左室舒张末期内径以及左心室室壁运动。6)血浆心房利钠肽（BNP ）检测评估心功能 BNP 水平于造模前后、移植后 3 及 6 个月经耳缘静脉抽血，采用双抗夹心 ELISA 法测定。6)血浆心房利钠肽（BNP ）检测评估心功能 BNP 水平于造模前后、移植后 3 及 6 个月经耳缘静脉抽血，采用双抗夹心 ELISA 法测定。7)磁共振评估心肌灌注和心功
22、能：分别于造模前后、移植后 3 及 6 个月，采用 3T 磁共振成像装置，体部相共振表面线圈及胸前导联心电门控技术测定左心室舒张末期容积、左心室收缩末期容积和 LVEF 等左室整体功能指标, 先从一个心电门控快速小角度激发电影脉冲序列中获得两个长轴位和 57 个短轴位图像。7)磁共振评估心肌灌注和心功能：分别于造模前后、移植后 3 及 6 个月，采用 3T 磁共振成像装置，体部相共振表面线圈及胸前导联心电门控技术测定左心室舒张末期容积、左心室收缩末期容积和 LVEF 等左室整体功能指标, 先从一个心电门控快速小角度激发电影脉冲序列中获得两个长轴位和 57 个短轴位图像。电影成像完成后静脉推注
23、0.20 mmol/kg 的钆双胺，10 分钟后从反转恢复快速小角度激发序列中获取钆增强图像。电影成像完成后静脉推注 0.20 mmol/kg 的钆双胺，10 分钟后从反转恢复快速小角度激发序列中获取钆增强图像。左心室容积、质量、和射血分数的评估使用电影 MRI 和自动化边界检测算法。左心室容积、质量、和射血分数的评估使用电影 MRI 和自动化边界检测算法。8）99mTc-SPECT 评估心肌灌注和心肌梗死面积：分别于造模前后、移植后 3 及 6 个月，评估心肌灌注,心肌活力及心肌梗死面积。8）99 mTcSPECT 的评估心肌灌注和心肌梗死面积：分别于造模前后，移植后 3 及 6 个月，评估
24、心肌灌注，心肌活力及心肌梗死面积。9）免疫组化检测：心脏标本采集及心肌组织固定、切片9）免疫组化检测：心脏标本采集及心肌组织固定、切片（1）心功能测定完成后，经右颈总动脉给予 10%高钾溶液使心脏停搏于舒张期。（1）心功能测定完成后，经右颈总动脉给予 10%高钾溶液使心脏停搏于舒张期。（2）迅速取出心脏，去除心脏表面脂肪组织及大血管，生理盐水冲洗干净，置（2）迅速取出心脏，去除心脏表面脂肪组织及大血管，生理盐水冲洗干净，置于 4%中性甲醛溶液固定 24 h。于 4% 中性甲醛溶液固定 24 h。（3）取出标本，从心尖部至心底部垂直于心脏长轴每隔 0.5 cm 取一厚约 0.2 cm（3）取出标
25、本，从心尖部至心底部垂直于心脏长轴每隔 0.5 cm 取一厚约 0.2 cm的心肌组织，共取 5 块，依次标号为 A、B、C 、D、E。的心肌组织，共取 5 块，依次标号为 A 、 B 、 C 、 D，E。（4）经全自动组织脱水机脱水处理后石蜡包埋。（4）经全自动组织脱水机脱水处理后石蜡包埋。（5）切取厚约 35m 左心室短轴面切片若干张。（5）切取厚约 35m 左心室短轴面切片若干张。部分切片行 HE 染色、Masson部分切片行他染色，Masson三色染色、网状纤维染色，其他序列切片进行免疫组织化学染色。三色染色、网状纤维染色，其他序列切片进行免疫组织化学染色。9.2 心肌切片 HE 染色
26、步骤9.2 心肌切片他染色步骤（1）切片入二甲苯脱蜡 5 min。（1）切片入二甲苯脱蜡 5 分钟。（2）二甲苯脱蜡 5 min。（2）二甲苯脱蜡 5 分钟。（3）100% 酒精 脱水 5 min。（3）100% 酒精 脱水 5 分钟。（4）100% 酒精 脱水 5 min。（4）100% 酒精 脱水 5 分钟。（5）95% 酒精 脱水 5 min。（5）95% 酒精 脱水 5 分钟。（6）95% 酒精 脱水 5 min。（6）95% 酒精 脱水 5 分钟。（7）80% 酒精脱水 5 min。（7）80% 酒精脱水 5 分钟。（8）70% 酒精脱水 5 min。（8）70% 酒精脱水 5 分钟
27、。（9）自来水冲洗 5 min。（9）自来水冲洗 5 分钟。（10）苏木素染色 3 min。（10）苏木素染色 3 分钟。（11）自来水洗去浮色。（11）自来水洗去浮色。（12）1% 盐酸酒精分色 10 s。（12）1% 盐酸酒精分色 10 多岁。（13）自来水返蓝 20 min。（13）自来水返蓝 20 分钟。（14）切片入 1%伊红染色 3 min。（14）切片入 1% 伊红染色 3 分钟。（15）自来水洗去浮色。（15）自来水洗去浮色。（16）入 90%酒精 30 s。（16）入 90% 酒精 30 多岁。（17）95% 酒精 5 min。（17）95% 酒精 5 分钟。（18）95%
28、酒精 5 min。（18）95% 酒精 5 分钟。（19）100% 酒精 5 min。（19）100% 酒精 5 分钟。（20）100% 酒精 5 min。（20）100% 酒精 5 分钟。（21）二甲苯透明 5 min。（21）二甲苯透明 5 分钟。1717（22）二甲苯透明 5 min。（22）二甲苯透明 5 分钟。（23）中性树胶封片。（23）中性树胶封片。a）心肌中 VSEL-SCs 和 MSCs 存在和分化的鉴定 以鼠抗猪 Brdu 单克隆抗体作为第一抗体，以荧光标记鼠抗猪 IgG 为第二抗体；根据荧光分布，以荧光显微镜观察 Brdu及 RFP 标记的细胞在心肌中的分布及重复移植组前
29、后两次移植的干细胞之间有无融合、趋化等现象。a）心肌中 VSEL-SCs 和 MSCs 存在和分化的鉴定 以鼠抗猪 Brdu 单克隆抗体作为第一抗体，以荧光标记鼠抗猪 IgG 为第二抗体；根据荧光分布，以荧光显微镜观察 Brdu及 RFP 标记的细胞在心肌中的分布及重复移植组前后两次移植的干细胞之间有无融合、趋化等现象。b）心肌纤维化的判断 采用 masson 三色染色、网状纤维染色判定 MI 后心肌纤维化及程度。b）心肌纤维化的判断 采用 masson 三色染色、网状纤维染色判定 MI 后心肌纤维化及程度。心肌切片 Masson 三色染色步骤心肌切片 Masson 三色染色步骤（1）切片脱蜡
30、处理至水。（1）切片脱蜡处理至水。（2）滴入试剂 A（Masson 复合染色液）染色 5 min，蒸馏水冲掉染液。（2）滴入试剂一（Masson 复合染色液）染色 5 分钟，蒸馏水冲掉染液。（3）滴入试剂 B（分化液）分化 3060 s （1 次） 。（3）滴入试剂 B（分化液）分化 3060 多岁（1 次） 。（4）滴入试剂 C（磷钨酸）染色 510 min，蒸馏水冲掉染液。（4）滴入试剂 C（磷钨酸）染色 510 分钟，蒸馏水冲掉染液。（5）滴入试剂 B 分化 3060 s （2 次） 。（5）滴入试剂 B 分化 3060 多岁（2 次） 。（6）滴加试剂 D（苯胺蓝）染色 5 min，蒸
31、馏水冲掉染液。（6）滴加试剂 D（苯胺蓝）染色 5 分钟，蒸馏水冲掉染液。（7）滴加试剂 B 分化 3060 s （2 次） 。（7）滴加试剂 B 分化 3060 多岁（2 次） 。（8）95% 酒精、无水酒精脱水，透明，中性树胶封固。（8）95% 酒精、无水酒精脱水，透明，中性树胶封固。心肌切片网状纤维染色步骤心肌切片网状纤维染色步骤（1）切片脱蜡处理至水。（1）切片脱蜡处理至水。（2）将试剂 A（氧化液）滴于切片上孵育 5 min，流水冲洗 1 min。（2）将试剂一（氧化液）滴于切片上孵育 5 分钟，流水冲洗 1 分钟。（3）将试剂 B（漂白液）滴于切片上，漂白至切片无色，流水冲洗。（3
32、）将试剂 B（漂白液）滴于切片上，漂白至切片无色，流水冲洗。（4）将试剂 C（媒染液）滴于切片上孵育 2 min，流水冲洗后再用蒸馏水洗 2（4）将试剂 C（媒染液）滴于切片上孵育 2 分钟，流水冲洗后再用蒸馏水洗 2次。次。（5）将试剂 D（银氨液）和试剂 E（稀释液）以 1:3 的比例混合均匀后，滴加（5）将试剂 D（银氨液）和试剂 E（稀释液）以 1:3 的比例混合均匀后，滴加于切片上孵育 5 min，后用蒸馏水速洗一次。于切片上孵育 5 分钟，后用蒸馏水速洗一次。（6）滴加试剂 F（还原液）孵育 3 min 至组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟。（6）滴加试剂 F（还原液）孵育 3 分钟至
33、组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟。（7）水洗，脱水，中性树胶封固。（7）水洗，脱水，中性树胶封固。c）梗死区微血管密度检测c）梗死区微血管密度检测anti-CD31 (Santa Cruz Biotechnology) primary 抗体免疫组织化学染色 followed by the addition of a tetramethylrhodamine B isothiocyanate-conjugated secondary antibody。反 CD31(圣 Cruz 生物技术）原发的抗体免疫组织化学染色根据 tetramethylrhodamine B isothiocyanate 的
34、附加跟随结合的中级抗体。请非本实验组 工作人员在普通光学显微镜 100 倍视野下计数毛细血管数量。请非本实验组工作人员在普通光学显微镜 100 倍视野下计数毛细血管数量。以 CD31 染色阳性以 CD31 染色阳性的内皮细胞作为血管标志，切片中任何可与周围组织明确区分的棕染内皮细胞及的内皮细胞作为血管标志，切片中任何可与周围组织明确区分的棕染内皮细胞及细胞群均作为一个血管计数。细胞群均作为一个血管计数。血管可无管腔，红细胞不作为血管标志。血管可无管腔，红细胞不作为血管标志。每张切片每张切片在梗死中心区及梗死周边区各选 5 个视野计数，取平均值。在梗死中心区及梗死周边区各选 5 个视野计数，取平
35、均值。d）心肌样细胞检测 以鼠抗猪结蛋白单克隆抗体和鼠抗猪心肌特异性肌钙蛋白单克隆抗体为一抗，免疫组化检测 MI 区及其周边有无心肌样细胞新生。d）心肌样细胞检测以鼠抗猪结蛋白单克隆抗体和鼠抗猪心肌特异性肌钙蛋白单克隆抗体为一抗，免疫组化检测 mi 区及其周边有无心肌样细胞新生。e）梗死面积测定：采用计算机图像处理系统测量各组猪心肌切片的心室肌总面积和心肌梗死面积，算出每只猪心室肌梗死面积占左心室横截总面积的百分比。e）梗死面积测定：采用计算机图像处理系统测量各组猪心肌切片的心室肌总面积和心肌梗死面积，算出每只猪心室肌梗死面积占左心室横截总面积的百分比。3.2 技术路线3.2 技术路线本项目通
36、过提取健康小型猪(20.0-30.0kg)骨髓，并分离、纯化、培养 VSEL-SCs、MSCs，采用 Brdu、RFP 标记首次和重复移植用的 NHSCs，制备猪 MI-HF 模型（造模后 LVEF 较造模前下降 5%以上） ，随机分为八组（共 80 只，n=10 ） ，单次移植VSEL-SCs、MSCs 组，重复 VSEL-SCs、MSCs 移植组，单次 VSEL-SCs、MSCs 移植2 倍量组，单次移植对照组，重复移植对照组。本项目通过提取健康小型猪 （20.0-30.0 公斤）骨髓，并分离、纯化，培养 VSELSCs 、 MSCs，采用 Brdu，RFP 标记首次和重复移植用的 NHS
37、Cs，制备猪 miHF 的模型（造模后 LVEF 较造模前下降 5% 以上） ，随机分为八组（共 80 只，n10） ，单次移植 VSELSCs，MSCs 组，重复 VSELSCs，MSCs 移植组，单次 VSELSCs，MSCs 移植 2 倍量组，单次移植对照组，重复移植对照组。另设非梗死模型阴性对照组。另设非梗死模型阴性对照组。经冠状动脉进行 VSEL-SCs、MSCs 移植，通过超声心动图、MRI、BNP 及 SPECT 等检查评估首次及重复 NHSCs 移植前后心功能和心肌灌注情况；RT-PCR 和 Western blotting 技术分别检测各组在不同时期血浆和心肌 SDF-1、F
38、GF 、HGF、IGF-1、VEGF等 mRNA 和蛋白表达；免疫组化法检测梗死面积、梗死区心肌 VSEL-SCs 和 MSCs的归巢数量、分化程度、内皮细胞密度、肌钙蛋白等。经冠状动脉进行 VSELSCs，MSCs 移植，通过超声心动图、磁共振成像，BNP 及 SPECT 等检查评估首次及重复 NHSCs 移植前后心功能和心肌灌注情况； RTPCR 的和西方人污点技术分别检测各组在不同时期血浆和心肌 SDF-1 、 FGF 、 HGF 、 IGF-1,VEGF 等 mRNA 和蛋白表达；免疫组化法检测梗死面积，梗死区心肌 VSELSCs 的和 MSCs 的归巢数量、分化程度、内皮细胞密度，肌
39、钙蛋白等。（图 2）探讨心肌中细胞因子的表达与干细胞归巢、分化的关系及首次 NHSCs 移植对重复移植的影响机制；研究等量的 VSEL-SCs、MSCs 通过单次和重复移植对梗死心肌修复的影响；评估重复移植的时机和价值。（图 2）探讨心肌中细胞因子的表达与干细胞归巢，分化的关系及首次 NHSCs 移植对重复移植的影响机制；研究等量的 VSELSCs，MSCs 通过单次和重复移植对梗死心肌修复的影响；评估重复移植的时机和价值。图 2：技术路线示意图图 2：技术路线示意图值；揭示两次 NHSCs 移植之间的相互作用机制。值；揭示两次 NHSCs 移植之间的相互作用机制。其流程图如下（图 2）：其流程图如下（图 2）：3.3 可行性分析3.3 可行性分析1)理论上的可行性1)理论上的可行性
