1、1分类号 编号烟 台 大 学 文 经 学 院毕 业 论 文（设 计）D301R固定化酶催化生产生物柴油最优条件Optimal conditions of immobilized enzyme D301 R catalytic production of biodiesel申请学位：生物工程 学士系 别：食品与生物工程系专 业：生物工程班 级：文生 085-1姓 名：徐昊学 号：200890519135指导老师：姜爱莉（副教授）2012 年 5 月 5 日烟台大学文经学院2D301R固定化酶催化生产生物柴油最优条件Optimal conditions of immobilized enzyme
2、D301 R catalytic production of biodiesel姓 名： 徐昊 导 师： 姜爱莉2012 年 5 月 5 日烟台大学文经学院3摘要 以 D301R 大孔树脂为载体进行脂肪酶的固定，通过单因素和正交实验优化固定化条件，得到高活性固定化脂肪酶并对其催化生产生物柴油的最优条件进行研究，结果表明：最优固定条件为：酶/树脂 10%（w/w） ，加水量 30%（w/w ） ，异辛烷中 4 下固定 5 h；催化反应的最优条件为：加酶量 67 mg/g,加水量 67 L/g,正己烷 0.5 mL/g,甲醇分三次流加，40 下进行反应；反应后 最高酯化率 为 67.24%。固定化
3、酶具有良好的酯化能力。关键词 大孔树脂；脂肪酶；固定化；生物柴油4Abstract：In this paper ,lipase was immobilized onto macroporous resin D301R. The immobilized conditions were optimized though single-factor test and orthogonal design. The Optimal conditions and esterifying capability of the immobilized lipase were systematically stu
4、died. The results showed that the optimum immobilized conditions were as follows: 10% lipase (enzyme/resin, w/w) was immobilized in isooctane microenvironment contained 30% water at 4 for 5 h. The optimal conditions for catalytic reaction were as follows: 67mg/g enzyme concentration (enzyme/ acid gr
5、ease, w/w) add in reaction system contained 67 L/g water and 0.5mL/g n-hexane, methanol added in three times, at 40 . The highest esterification rate after reaction was 67.24%. Immobilized lipase displayed good esterification ability .Key words：macroporous resin；lipase；immobilization；biodiesel5目 录1
6、文献综述 .11.1 生物柴油简介 .11.2 生物柴油生产方法 .11.3 脂肪酶的简介 .21.4 固定化酶简介及固定化方法 .31.4.1 吸附法 .31.4.2 共价结合法 .41.4.3 交联法 .41.4.4 包埋法 .41.5 游离脂肪酶与固定化脂肪酶的比较 .41.6 国内外研究进展 .51.7 立题意义及背景 .62 材料与方法 .72.1 实验材料 .72.1.1 实验仪器 .72.1.2 实验原料及试剂 .7实验方法 .82.2.1 固定化载体预处理 .82.2.2 固定化载体制作流程 .82.2.3 脂肪酶的固定化 .82.2.4 脂肪酶水解活力的测定 .82.2.5
7、固定化条件优化 .92.2.6 固定化酶催化酯化反应条件优化 .92.3 分析方法 .92.3.1 酸价的测定 .92.3.2 酯化率的计算方法 .102.3.3 酶活力测定 .102.3.4 固定化酶固定稳定性 .103 结果与分析 .123.1 壳聚糖/树脂比例对固定化的影响 .123.2 戊二醛浓度对固定化的影响 .123.3 脂肪酶固定化正交试验 .133.4 固定化酶催化酯化反应条件优化 .143.4.1 酶用量的影响 .143.4.2 水含量的影响 .153.4.3 有机溶剂种类影响 .163.4.4 有机溶剂用量的影响 .163.4.5 反应温度的影响 .173.4.6 甲醇流加
8、次数影响 .18结论 .20致谢 .21参考文献 .22烟台大学文经学院毕业论文(设计)11 文献综述当前，全球经济发展迅猛，对石油的依赖和需求不断增强，由于石油资源逐渐枯竭，从而导致了历年来国际油价不断攀升，2008 年更是突破每桶 100 美元大关，后来一度逼近每桶 150 美元，当前油价虽略有下调，但能源危机已经成为制约世界经济发展的重要因素 1。另一方面，由于工业高度发达，大量的石化燃料燃烧排放了过多的 CO2 等废气，造成温室效应、酸雨等破坏，导致了全球性的环境恶化。能源危机和环境污染成为当今人类面临的两大难题。为了缓解这两大世界难题，人类正努力寻找可替代的清洁能源，生物柴油作为一种
9、绿色的可再生的替代能源，已引起全球的关注与重视。生物柴油可生物降解，无毒，可燃烧，是一种环境友好型燃料。20 世纪 80 年代以来，生物柴油的生产技术迅速发展，世界各国一直在制定开发可再生资源规划，生物柴油研究正蓬勃发展。1.1 生物柴油简介生物柴油(Biodiesel fuel)是脂肪酸单烷基混合物 2，是以油料作物和水生植物油脂以及动物油脂等为原料油，通过酯交换工艺制成的可再生性柴油燃料 3。是用油脂或长链脂肪酸与甲醇等低碳醇合成的脂肪酸甲酯 4。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物，这些混合物主要是一些分子量大的有机物。目前生物柴油主要是用化学法生产，以甲醇为溶剂，用强酸或强碱催化
10、动植物油脂制备。但化学法存在工艺复杂，醇消耗量大，产物不易回收，环境污染大等缺点。利用酶法生产生物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染物排放等优点，但低碳醇转化率低，酶的成本高，酶的寿命短仍是此类方法需要解决的问题 5。因此，为降低生产成本和改善催化效率，国内学者开展了一系列工作，并获得了一些最新的研究成果。1.2 生物柴油生产方法目前为止，制备生物柴油方法有以下四种，分别是：直接混合法 6、乳化法、 7、高温裂解法 8和酯交换法 9。(1)直接混合法直接混合法是将植物油和石化柴油按照一定比例混合，使植物油的密度降低、粘度下降，直接作为发动机燃料。该方法虽然工艺简单，但是生物柴油质
11、量不高，长期使用会造成堵塞喷嘴、无法继续工作等问题。(2)微乳化法微乳化是将植物油与甲醇、乙醇和 1-丁醇等溶剂形成微乳化液，从而使植物油稀释降低粘度。该方法工艺简单，但是受到环境条件的限制，环境条件的变化会发生破乳现象。(3)高温裂解法烟台大学文经学院毕业论文(设计)2高温热解是在高温或高温和催化剂的作用下，使植物油的分子链断裂，转化为结构简单的小分子物质。该方法过程简单，没有污染物产生，但是裂解设备昂贵，稳定性稍差，造成产品成本过高，不能达到工业化生产的程度。(4)酯交换法该方法是用低碳醇，与甘油三酯反应，取代甘油三酸酯的甘油基，形成脂肪酸低碳醇酯。多用甲醇和乙醇两种低碳醇，其中甲醇最常用
12、，一方面是由于甲醇价格较低，另一方面是由于其具有碳链短、极性强等特点，能够很快与脂肪酸甘油酯发生反应，通过反应可降低甘油三酯的黏度。酯交换法又可分为三种类型，分别是：化学催化法、超临界流体法和生物酶法。化学催化法化学催化法又分为碱催化法和酸催化法。酸催化法产率高，但产物分离困难，反应速度慢，且容易对环境造成污染。而碱催化法反应速度快且转化率高，但由于游离酸会使催化剂中毒，因此不能处理地沟油、酸化油等废油，而且还存在着副反应多、乳化现象严重、污染环境的缺点。超临界流体法超临界流体法是将在超临界状态下的醇类物质与油脂类物质进行酯交换反应。该法的产率较高，同时避免了使用催化剂所必须的分离纯化过程，但
13、是其反应设备要求高、能耗大、生产容量小、生产成本高。生物酶法生物酶法是用脂肪酶替代酸碱催化剂，催化油脂与低碳醇进行酯交换反应。因为酶作为一种生物催化剂具有很高的催化效率。该法反应条件温和、产物提取简单、醇用量小、甘油易回收，并且无污染排放。但是，酶的稳定性不高，容易被甲醇毒害而失活，因此，人们开始关注固定化酶的制备，以提高其稳定性和使用寿命。图1 油脂与甲醇酯交换反应方程式Fig. 1 The reaction equation of oil and methanol transesterification1.3 脂肪酶的简介脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘
14、油和甘油单酯或二酯。它是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油烟台大学文经学院毕业论文(设计)3酯及其他一些不溶性酯类的水解、醇解、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，具有高效、高选择性、条件温和和环境友好等特点 10。脂肪酶在不同反应体系中发挥活性作用，在有机相中可以酶促合成酯交换，而在水界面促进酯水解。脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。脂肪酶结构有 2 个特点：(1)脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly 或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W 、Z 是可变的氨基酸残基)；(2)活性中心是
15、丝氨酸残基，正常情况下受 1 个 -螺旋盖保护 11。1.4 固定化酶简介及固定化方法固定化酶(immobilized enzyme)，酶本身还是溶于水的，是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，酶即可以表现催化活性又可以重复利用。经过物理或化学方法处理后的酶，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱
16、人的应用前景。酶固定化方法有吸附法、共价结合法、交联法、包埋法。酶经过固定化后，比较能耐受温度及 pH 的变化，最适 pH 往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍甚至几百倍。1.4.1 吸附法吸附法是利用酶与载体吸附剂之间的非特异性吸附作用，将酶吸附在载体上。吸附法一般分为离子吸附法和物理吸附法。(1)离子吸附法是将酶与含有离子交换基的不溶性载体相结合的固定化方法。此法操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是酶与载体之间的结合容易受缓冲液种类或 pH 值的影响，在高离子强度时，酶往往会从载体上脱落。此法的载体有 DEAE、纤维素、离子交换树脂、纤维素
17、等。(2)物理吸附法具有酶的活性中心不易被破坏和酶的高级结构变化少的特点，酶活力损失很少，但酶与载体相互作用力弱、酶易脱落。常用的载体有无机载体如氧化铝、多孔玻璃、硅胶、高岭土、皂土等；有机载体如面筋、活性炭、淀粉等。烟台大学文经学院毕业论文(设计)41.4.2 共价结合法共价结合法是指将酶蛋白分子上功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连结的方法。酶与载体间连接牢固，使用过程中不易发生酶脱落，并且具有良好的稳定性及重复使用性，因此成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但是该方法具有反应条件比较强烈、载体的活化或固定化操作比较复杂等缺点，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较
18、高的固定化酶。1.4.3 交联法交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三维的交联网架结构。除了酶分子之间发生交联外，可能还存在着一定的分子内交联。戊二醛是应用最广的双功能试剂，它与酶的游离氨基反应，形成希夫碱而使酶分子交联。此外，可用作交联剂的还有 4,4-异硫氰二苯基-2,2-二磺酸、双重氨联苯胺、六甲基二异氰酸、甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸等。交联法广泛应用于酶膜和免疫分子膜的制备，操作简单，结合牢固1.4.4 包埋法包埋法是将酶包埋于半透性的载体之中制成固定化酶，包括网格型和微囊型两种。该方法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变
19、酶的高级结构，因此可以得到活力较高的固定化酶。但由于固定化基质表面的孔径有限，许多大分子底物和产物难以扩散，所以该法对于作用于大分子底物的酶是不适用的，特别是对于甘油三酯。1.5 游离脂肪酶与固定化脂肪酶的比较脂肪酶催化法制备生物柴油可使用游离脂肪酶，也可使用细胞外脂肪酶或细胞内脂肪酶。对于细胞外脂肪酶和细胞内脂肪酶而言，一般可固定在载体中，减少分离纯化及回收步骤。而且，经固定化的胞外脂肪酶或胞内脂肪酶催化生产生物柴油的效果优于游离脂肪酶。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：(1)有利于酶与底物、产物的分开，实现酶的可重复使用，从而使酶的使用效率大大提高，降低使用成本；(2)固定化酶具有一定的
20、机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化；(3)在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可延长使用和贮烟台大学文经学院毕业论文(设计)5存时间；(4)酶的催化反应过程更易控制。如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶接触，即可使酶反应终止；(5)固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染、纯度较高的产物，简化了提纯工艺，提高了产量和产品质量；(6)比可溶酶更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行；(7)辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体系合并使用，从
21、而扩大其应用范围。1.6 国内外研究进展酶法生产制备生物柴油具有条件温和，醇用量低，产物易于分离，污染小及对原料油脂品质要求低等优点。但在生产过程中，酶法催化存在成本较高，反应效率低，生产周期长等缺点 12。因此，针对降低生产成本和提高催化效率，国内外学者开展了一系列工作，获得了一些最新的研究成果。杨艳红等 13以硅藻土为固定化酶载体，在 pH7.5，给酶量 33374 Ug-1，温度 35 ，固定 4 h 条件下，得到固定化酶活力约为 5833 Ug-1。得到的固定化酶热稳定性好。固定化酶重复使用八次，相对酶活力不到 50，操作稳定性较好。以二氧化硅纳米材料为固定化酶的载体，在 pH7.5，
22、给酶量 28300 Ug-1，温度 45 ，固定化 10 h 条件下，得到的固定化酶活力约为 3867 Ug-1。固定化酶的热稳定性和 pH 稳定性比游离酶明显提高。固定化酶重复使用八次，相对酶活力在 75以上，操作稳定性较好。以凹凸棒石为固定化酶的载体，在 pH7.5，给酶量 25900 Ug-l,温度 25 ，固定 5 h，得到固定化酶活力约为 2800 Ug-1。固定化酶的热稳定性和 pH 稳定性也都比游离酶有了更大的提高。固定化酶重复使用八次，相对酶活力不到50，操作稳定性较好。李昌珠等 14通过正交试验优化了生物柴油催化剂固定化酶活力测定的最佳条件，比较了固定化酶与游离酶的性能，测定
23、固定化酶活力的最佳条件为反应时间 20 min，温度 43 。与游离酶比较，固定化酶最适反应温度提高，贮藏稳定性和操作稳定性都有大幅度提升。金杰等 15以凹凸棒石为固定化载体，采用吸附法，对脂肪酶进行固定。得到最佳固定化条件：固定化温度为 25，pH 值为 7.5，吸附时间为 5 h，此时固定化酶的活力约为 2800 U/g 载体。固定化酶的热稳定性和 pH 稳定性较游离酶有了较大改善，其在 60以下能保持 75%以上的酶活。在 pH 为 5-9 的范围内，固定化酶的酶活能保持 70%以上。吴茜茜等 16研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化的影响。所得固定化酶的半失活温度由游离酶的 47
24、提高到 100，与游离酶相比较，酶促烟台大学文经学院毕业论文(设计)6反应的最适温度由 40提高到 80，高温性温度范围相应增大。在高温条件下，固定化酶连续 10 次转化底物反应，仍保持较高的催化活性。李浔等 17研究了用于生物柴油酶催化的大孔树脂固定化脂肪酶的制备过程，采用大孔树脂 D3520 作载体，以载体涂布法固定化脂肪酶的最适固定化条件为：酶用量:树脂=0.16:1（质量比），吸附时间 l-3 h，pH 值范围为 9.0-9.4，固定化温度 40。酶活力可达 91.49 U/g，酶活回收率约为 54。王章存等 18以大孔树脂为栽体，吸附法固定化脂肪酶。以 pH8.5，0.1 mol/L
25、 的磷酸盐缓冲液为介质，在酶液浓度 20 mg/mL，固定化温度 35的条件下，吸附 4 h，得固定化酶水解活力为 137.39 u/g，固定化酶的最适 pH 和温度都比游离酶高。该固定化脂肪酶催化合成结构脂质，连续使用 4 批催化活力没有任何改变，具有较高的操作稳定性。刘汝宽等 19以大孔树脂 D3520 作载体，在离子强度为 0.04mol/L、pH8.8 的甘氨酸一 Na0H 缓冲溶液中固定化，得到的固定化酶活力达 199.42 U/g，在 4冰箱中保存 40 天其活力仍保持 90%以上。固定化酶具有更好的温度和贮藏稳定性，同时使用后能够回收，具有较高使用效率。Ha 等 20在 23 种
26、离子液体介质下，将 C.antarctica 脂肪酶固定化催化大豆油与甲醇的酯交换反应。结果发现在EmimOTf中的催化效果较佳，转化率达80% 以上。日本大阪市政科技研究 21，成功的将甲醇流加三步法简化为两步法。利用Novozymes435生产的固定化假丝酵母脂肪酶 Novozym435催化转酯化植物油脂，每次甲醇加入量为1/3摩尔当量，30 下反应48 h 转化率达到97.3%。其中剩余的2/3甲醇一次性加入，反应简化成两步。反应36h 后转化率达到96.8% 。1.7 立题意义及背景酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术
27、。我国从 20 世纪 60 年代开始微生物脂肪酶的研究开发，70 年代工业化生产脂肪酶制剂，目前已有许多学者就脂肪酶的固定化展开了实验室研究，但商业化技术尚不成熟。经过多年的研究和发展，固定化酶技术已取得了长足的进步，先后开发了多种固定化方法和性能多样的载体材料，取得了丰硕的成果。但是真正实现工业化应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化成本较高、固定化效率及稳定性差、连续操作使用性还有待提高。目前，人们正进一步开发更简便、更适用的固定化方法以及性能更加优异的载体材料，以期有更多的固定化酶取得工业规模的应用本文主要集中讨论自制 D301R 脂肪酶的催化条件，对加酶量、去离子水用量、有机溶剂种类及
28、用量、反应温度、甲醇流加方式等对催化过程的影响进行了分析。、可为酶法催化生产生物柴油提供理论依据。烟台大学文经学院毕业论文(设计)72 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验仪器表 1 实验仪器与生产厂家Tab. 1 Apparatus required for this test and related manufacturers仪器名称 型号 生产厂家恒温培养摇床 THZ-100 昆山一恒仪器有限公司千分之一天平 PL203 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司电子天平 SE602F 奥豪斯国际贸易（上海）有限公司可见分光光度计 722 上海菁华科技仪器有限公司循环水式真空泵 SHZD()
29、 巩义市予华仪器有限责任公司低速大容量多管离心机 LXJ-IIB 上海安亭科学仪器厂移液器真空干燥箱 DZF6050 上海精宏实验设备有限公司旋转蒸发器 RE52AA 上海亚荣生化仪器厂2.1.2 实验原料及试剂实验原料为大豆油，市售。实验试剂见表 2。表 2 实验试剂名称、规格及生产厂家Tab. 2 Reagents required for this test and related specifications and manufacturers试剂 规格 生产厂家脂肪酶 绿维康氢氧化钠（NaOH） 上海山海工学团实验二厂酚酞 天津市广成化学试剂有限公司大豆油 烟台尤源油食品有限公司油酸
30、 分析纯 AR 天津市巴斯夫化工有限公司氢氧化钾（KOH） 分析纯 天津市大茂化学试剂厂甲醇 分析纯 西陇化工股份有限公司乙醇（95% ） 分析纯 AR 天津市永大化学试剂有限公司正己烷 天津市科密欧化学试剂有限公司烟台大学文经学院毕业论文(设计)8石油醚 分析纯 天津市永大化学试剂有限公司异辛烷 分析纯 天津博迪化工股份有限公司环己烷 分析纯 天津博迪化工股份有限公司戊二醛 分析纯 天津博迪化工股份有限公司醋酸 分析纯 天津市瑞金特化学品有限公司牛血清白蛋白 BSA 高级纯 上海洛神生物技术有限公司实验方法2.2.1 固定化载体预处理大孔树脂用 75%乙醇浸泡 12 h，抽滤后蒸馏水冲洗，真
31、空干燥至恒重待用。阳/阴离子交换树脂用 5% NaOH/HCl 浸泡 12 h，水洗至中性，再用 5% HCl/ NaOH 浸泡 12 h，水洗至中性，磷酸缓冲液浸泡 12 h 后真空干燥至恒重待用。将壳聚糖溶解在质量分数为 10%的醋酸溶液中，按比例加入装有 D301R 大孔树脂的三口瓶中，抽真空使壳聚糖吸附在树脂的内外表面，抽滤载体，用蒸馏水洗至中性，干燥得到固定化载体。2.2.2 固定化载体制作流程5 gD301R 型大孔树脂 加 10 mL1%壳聚糖在旋转蒸发器上抽真空混合10 min，让树脂与壳聚糖充分混合用清水洗净多余的壳聚糖 放入真空干燥箱 40 直到完全干燥 5 g 树脂浸泡于
32、 25 mL0.125%的戊二醛溶液中 1 h真空干燥箱 40干燥的到固定化的载体。2.2.3 脂肪酶的固定化准确称取 5 g 载体，置于 250 mL 锥形瓶中，加入少量去离子水润湿载体，再加入适量的脂肪酶与载体充分混合，加入有机溶剂异辛烷形成固定化微环境，0-4 固定一定时间。吸附结束后用相同有机溶剂淋洗固定化酶，室温真空干燥，待用。2.2.4 脂肪酶水解活力的测定采用橄榄油乳化法 22，40 ，pH7.5 条件下每催化产生 1 mol 脂肪酸的酶量定义为一个酶活单位。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法分钟，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。烟台大学文经学院毕业论文(设计)92.2.5 固定化条件优
33、化以固定化温度、时间、加酶量、加水量为试验因素，以固定化酶的水解活力为试验指标，进行 4 因素 4 水平正交试验。2.2.6 固定化酶催化酯化反应条件优化改变反应中固定化酶的用量测定酶用量对转酯化反应的影响；改变反应体系中水含量测定水含量对转酯化反应的影响；将异辛烷、石油醚、环己烷、正己烷分别作为反应中的有机溶剂测定不同有机溶剂对转酯化反应的影响；改变反应体系中正己烷用量测定不同有机溶剂用量对转酯化反应的影响；改变反应温度测定不同温度对转酯化反应的影响；逐步增加流加甲醇次数，测定不同甲醇量对转酯化反应的影响。2.3 分析方法2.3.1 酸价的测定 232.3.1.1 溶液的配制(1) 0.2
34、mol/L 氢氧化钾-乙醇溶液 精密称取氢氧化钾 11.22 g，用 95%乙醇定容至 1000 mL。(2) 酚酞指示剂 精密称取酚酞 0.5 g，加 100 mL95%乙醇溶解。(3) 35%(w/w)含酸油脂 35 g 油酸加入 65 g 大豆油中。(4) 0.125%(v/v)戊二醛 戊二醛 125 L 稀释定容到 100 mL(5) 10%(v/v)醋酸溶液 100 mL 冰乙酸用去离子水稀释定容到 1000 mL(6)1%壳聚糖2.3.1.2 酸价测定方法称取样品 1 g 左右，加 15 mL95%乙醇溶解，加几滴酚酞指示剂，用 0.2 mol/L 氢氧化钾- 乙醇溶液滴定滴定到终
35、点，记录消耗氢氧化钾的体积。按照以下公式计算酸价： mc1.56V酸 价式中 V所用氢氧化钾标准液的体积，mL烟台大学文经学院毕业论文(设计)10c所用氢氧化钾标准液的准确浓度，mol/Lm样品的质量，g56.1氢氧化钾的摩尔质量，g/mol2.3.2 酯化率的计算方法 24 %10%原 始 酸 价反 应 后 酸 价原 始 酸 价酯 化 率2.3.3 酶活力测定2.3.3.1 溶液的配制(1) 2%聚乙烯醇（PVA）溶液 少量水煮沸加入 5.0 g 聚乙烯醇完全溶解，滤布过滤后定容至 250mL 备用。(2) 乳化液 橄榄油与 PVA 溶液按 1:4 在匀浆机中制成乳化液，现配现用。(3) 0
36、.025 mol/L 氢氧化钠溶液 精密称取氢氧化钠 1 g，溶解并定容至 1000 mL。2.3.3.2 酶活力的测定方法称取固定化酶 10 mg 加 5 mL 磷酸缓冲液、4 mL 乳化液，40摇床反应 15 min 后，加 15 mL 酒精使酶失活，以酚酞为指示剂，用 0.025 mol/L 氢氧化钠溶液滴定。测定时取三组平行，一组空白，空白先加 15 mL 酒精使酶失活。按照下式计算酶活力： wtcABX310)(式中 X酶活力，u/gB滴定试样所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mLA滴定空白试样消耗的氢氧化钠标准溶液的体积， mLt反映时间，minw加入固定酶的质量，g2.3.4 固定
37、化酶固定稳定性2.3.4.1溶液配制考马斯亮蓝 R250 烟台大学文经学院毕业论文(设计)11考马斯亮蓝 100 mg 加 50 mL95%乙醇加 100 mL85%磷酸(H 3PO4)，定容1000 mL2.3.4.2 稳定性测定采用考马斯亮蓝比色法，以牛血清白蛋白为标准蛋白做标准曲线。取固定化酶 50 mg 与三角瓶，加去离子水 25 mL 在 40 180 r/min 摇床, 分别在第0，5，10，15 min 时取上瓶中清液 1ml，加考马斯亮蓝 4ml，测其吸光度。烟台大学文经学院毕业论文(设计)123 结果与分析3.1 壳聚糖/树脂比例对固定化的影响树脂吸附的壳聚糖量多少,是影响酶
38、固定化的重要因素。从图 2 可见,在一定范围的壳聚糖浓度下,随着壳聚糖量的增加,固定化酶的催化活力逐渐升高;当壳聚糖超过一定量时,多余的壳聚糖堵塞树脂孔径导致树脂比表面积减少，引起酶吸附量减少，从而固定化酶的催化活力逐渐降低。因此本实验中,壳聚糖/树脂的比例是 1:120。1:01:01:201:301:401:5050607080901010相对酶活 (%) 壳 聚 糖 浓 度 与 树 脂 的 比 例图 2 壳聚糖浓度对脂肪酶固定化的影响Fig.2 The impact of chitosan concentration on the immobilized lipase3.2 戊二醛浓度对
39、固定化的影响以戊二醛作为交联剂，考察不同交联剂浓度对固定化的影响，结果如图3，当戊二醛浓度较低时酶活力随着戊二醛浓度增加而增加，当戊二醛浓度超过0.125%时，酶活随戊二醛浓度逐渐降低。当交联剂的浓度为 0.125%时，固定化酶活力最高。烟台大学文经学院毕业论文(设计)13-0.20.0.20.40.60.81.01.22040608010120相酶对活 (%) 戊 二 醛 浓 度 (%)图 3 戊二醛浓度对脂肪酶固定化的影响Fig.3 The impact of glutaraldehyde concentration on the immobilized lipase3.3 脂肪酶固定化正
40、交试验以大孔树脂 D301R1%壳加聚糖 0.125%交联剂为固定化载体，异辛烷为固定化介质，固定化酶水解活力为试验指标，固定化时间、温度、加酶量、加水量为试验因素，采用 L16(54)正交表进行试验，结果和极差分析见表。表 3 脂肪酶固定化正交实验结果Tab. 3 Results of immobilized lipase orthogonal experimentA温度 / B时间/h C加酶量/（w/w） D加水量/（w/w） E 酶活U/g1 4 2 5% 30% 1 2 633.332 4 3 10% 40% 2 3 686.703 4 4 15% 50% 3 2 955.564 4
41、 5 20% 60% 4 3 850.005 10 2 10% 50% 4 3 110.006 10 3 5% 60% 3 1 923.337 10 4 20% 30% 2 3 633.338 10 5 15% 40% 1 3 235.569 25 2 15% 60% 2 2 390.0010 25 3 20% 50% 1 2 616.6711 25 4 5% 40% 4 1 900.0012 25 5 10% 30% 3 3 450.0013 40 2 20% 40% 3 3 150.0014 40 3 15% 30% 4 3 311.1115 40 4 10% 60% 1 3 676.67
42、16 40 5 5% 50% 2 1 822.22烟台大学文经学院毕业论文(设计)14K1 13125.59 11283.33 8278.88 13027.77K2 11902.22 11537.81 13923.37 11972.26K3 10356.67 12165.56 11892.23 10504.45K4 11960.00 12357.78 13250.00 11840.00表 4 方差分析Table 4 Variance analysis因素 偏差平方和 自由度 F F0.05 显著性温度 1252867.662 3 5.503 9.280 不显著 时间 291751.377 3
43、1.281 9.280 不显著加酶量 4369737.992 3 19.192 9.280 显著加水量 832204.966 3 3.655 9.280 不显著误差 227683.55 3 由表 3 可知，各因素对脂肪酶固定化效果影响的主次顺序为加酶量温度加水量 时间，各因素最佳组合为加酶量 10%，加水量 30%，在 4 下固定化 5 h。在此条件下进行验证试验，重复 3 次，测得固定化酶的酶活 4 100.3212.59 U/g。由表 4 可知，加酶量的 F 值达到显著水平，即加酶量因素显著，先确定加酶量因素为最优水平，再确定其他因素。3.4 固定化酶催化酯化反应条件优化3.4.1 酶用量
44、的影响酶用量对催化酯化反应有重要影响，酶用量过低反应缓慢，催化效率低；酶用量过高会导致浪费。适合的酶用量不但可以有效催化转酯化反应还可以节约成本。分别加入不同量的固定化酶，催化结果如图 1，酶用量越大相对酯化率越大，催化效果越明显，当酶用量占含酸油脂质量的 6.67%(w/w)相对酯化率较高，即 6 g 含酸油脂对应 400 mg 固定化酶，酶用量适中，为最优酶用量。烟台大学文经学院毕业论文(设计)152 4 6 802040608010120相对酯化率 (%) 酶 用 量 (%)图 4 不同酶用量对转酯化反应的影响Fig. 4 The impact of different enzyme d
45、osage on transesterification3.4.2 水含量的影响固定化酶在催化转酯化反应时需要少量水存在，图 2 中可看出当水含量为含酸油脂质量的 6.67%(w/w)时，即 6 g 含酸油脂对应 400 L ，相对酯化率最高，为最优含水量。6 9 1202040608010120相对率酯化 (%) 水 含 量 (%)图 5 不同水含量对转酯化反应的影响Fig.5 The impact of different water dosage on transesterification烟台大学文经学院毕业论文(设计)163.4.3 有机溶剂种类影响考察了无溶剂体系和以异辛烷、正己烷
46、、环己烷、石油醚为溶剂的体系酯交换反应的情况，实验结果见图 3。图可见，与无溶剂体系相比，加入溶剂以后，酯交换反应的转化率提高。这可能是因为加入溶剂以后，反应底物被稀释，与酶接触的机会增大，并且能够提高底物和产物之间的传质，降低短链醇在底物中的含量，降低短链醇对酶蛋白的毒性，从而提高了酶催化过程中的反应速率【固定化脂肪酶催化制备生物柴油王学伟】 。从几种溶剂的效果来看，选用正己烷作为溶剂较适宜。无 溶 剂 异 辛 烷 石 油 醚 环 己 烷 正 己 烷0306090120相对酯化率 (%) 有 机 溶 剂图 6 不同有机溶剂种类对转酯化反应的影响Fig.6 The impact of diff
47、erent organic solvents on transesterification3.4.4 有机溶剂用量的影响由 3.2.3 得出最优有机溶剂为正己烷，考察了不同正己烷用量对转酯化反应的影响。正己烷提供反应的环境。但正己烷加入量越大，则甲醇与酶的实际接触面积越小，反应越不充分，相对酯化率越低。当正己烷加入量与含酸油脂质量比为 33%(w/w)时，即 6 g 含酸油脂对应 3 mL 正己烷为最佳。烟台大学文经学院毕业论文(设计)17030609012002040608010120相对酯化率 (%) 有 机 溶 剂 用 量 (%)图 7 不同正己烷含量对转酯化反应的影响Fig.7 The
48、 impact on different N-hexance content on transesterification3.4.5 反应温度的影响温度是影响酶催化反应的一个重要参数，选择适当的反应温度不但可以提高反应速度，还有助于延长酶的使用寿命。有利于反应平衡向产物生成的方向移动。在一定的温度范围内，温度升高，反应物碰撞频率增加，酶反应速度加快；但温度超过一定范围时，由于酶蛋白变性。酶活性下降，酶反应速度反而下降。由图可知，在所研究的温度范围内，酶促反应速度随温度的升高而增大但当温度高于 40时，随温度的升高催化效率增加缓慢，在 40时，相对酯化率最高，所以反应温度在 40较为适宜【固定化
49、 8 旨肪酶催化活性影响因素的改变对生物柴油转化率的影响】 。烟台大学文经学院毕业论文(设计)18室 温 30 40 5002040608010120相对酯化化率 (%) 温 度图 8 不同反应温度对转酯化反应的影响Fig.8 The impact of different temperature on transesterification3.4.6 甲醇流加次数影响脂肪酶催化酯交换反应时，甲醇与原料油的摩尔比通常为 3:1，但高浓度的甲醇很容易引起酶的失活。为进一步探索甲醇浓度对脂肪酶活性的抑制作用，本试验甲醇总量一定，加入方式为一次性加入、分两次等量每隔 6 h 加入、分3 次等量每隔 4 h 加入、分 4 次等量每隔 3 h 的方式研究甲醇加人对酶活性的影响。反应 12 h 考察甲醇加入方式对酶活性的影响，结果如图。当甲醇一次性加入到反应体系中，反应结束时，相对酯化率很低，甲醇分 3 次和 4 次加入的体系中，反应结束时相对转化率较高。甲醇按理论反应
