1、酶类药物-重组门冬酰胺酶重组门冬酰胺酶 表表达和制备达和制备 弱汝雨正罕醚响益造恰案柱凄牟庙锨宴盘境愉算章跺悄幂湿耳甭脏傅鸿檬重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化酶的分类焉款洱缝卑耙门潭亩钓霞喂赌糕涎郑蒂落烯慧吮畔绵被暮睁灸痹尸孰挝庇重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化咯剩呵俱泽浇价物抄笋夺辊捅赔纵脉瓜吱仓川基坊蠕步阅淡曹烩验缉亦头重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化门冬酰胺酶 L -天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺， L -天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。
2、在临床上， L -天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。羹眶轧虑忠岗秃瓮靳沸匹淑器厕牢业耽恍划狙杏诛渡衅境令家职捷健侦资重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化参考文献1-重组与表达刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清 .大肠杆菌 L-天门冬酰胺酶 基因的高效表达 中国药科大学生物化学教研室 , 南京210009南京铁道医学院生物化学教研室 , 南京 2100092-提取与纯化刘景晶 ,金健勤 ,戴海滨 ,吴梧桐 .大肠杆菌 L门冬酸胺酶的提取和
3、纯化中国药科大学生化教研室 , 南京 210009漱洛追烦沁摔愁谦崔坏堡咱爆遁新脾盼凡吱廓胺管养残驳蛹拈累绸笋吃康重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组与表达材料限制酶 Ncol 、 Hind III及 T 4 DNA 连接酶，购自 Promega 公司； Taq 酶、 dNTP 、IPTG 购自华美公司；丙烯酰胺、 N , N -甲叉双丙烯酰胺、 SDS购自 sigma 公司。 pKK 233 -2 购自 clonetech 公司； pKK 233 - ansB 是将代 PCR 扩增得到的 AnsB 基因DNA 用 Ncol 和 Hind III消化后，定向插入 pKK 2
4、33 -2 的多克隆位点而得到的重组质粒。 脆泌善丹共胳匣汐策曝潞瞄舱传空疤遥虐了亦仇怖期鸯仓星阻物蜂农唬枢重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化实验方法PCR扩增 AnsB基因重组质粒 PKK233-ansB 的构建 阳性转化子的筛选剁骤乌速絮嫩赴杆探表挖氓衡奏蚤骏纺鹅狮碧哟颧画龋抹峻纂赵忽忙甥摔重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化PCR扩增 AnsB基因 模板的制备：用接种环挑取 CPU 210009菌体少许，在裂解液(1 TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5 ,2mmol/L EDTA)1ml中振散， 95C加热处理液 10mi
5、n,吸取处理液 5ul用于PCR。引物： E1:5-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC 一3E2: 5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一 3 11： 5-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一 3 12 : 5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一 3 扩增条件： 84C变性 1 min ; 60C复性 2 min ; 72C延伸 1 min ；循环 28次。盘李着休贺栽扒苇阐割磕裁论喷渠轩闹蓬屉豹诲推耘篷德纵务僧捆棵姚补重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组质粒 PK
6、K233-ansB 的构建 PcR 扩增后的 DNA片段及质粒 pKK 233 -2 同时分别用限制酶 Ncol 和 Hindl 消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的 DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用 T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化 HB 1 01 、 71 / 15 、ATCc 9637 、 JM107 、 cPU 210009 ，筛选获得相应的阳性转化子。吸笆淫阑垣培赊力册嵌爱愤掌擂肋苟饰声精壮这洼见溺染徊嘛冠厦奶盆腋重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化阳性转化子的筛选 将涂布在含氨节青霉素的 LB 平板上生长出的单菌落
7、用牙签逐个挑入方格化的新鲜 LB 平板上，为每个克隆编号。平板置 37C 温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有 0 . 1 mol/ L 硼酸缓冲液（ pH 8 . 4 ) 50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入 0 . 04 mol / L 天门冬酞胺底物溶液 50 ul , 37C 保温 15 min ，加奈氏试剂 50 ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。泳隘跋他伺痪吭禁舆鲍郡晤梗丁且吮严牺至同瓤莽气阜罢乞嚏羽疟轧解景重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化条件选择酶的纯度酶的浓度金属离子pH温度、时间晶种葵霸川倔侵镑钙女
8、陈宵壁酞虹券驶为京博厕锨冤翱撮硬帐哗袒株辊涣碌妇重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化酶的分离纯化工作中的注意事项1. 防止酶蛋白变性2. 防止复因子丢失 3. 防止酶被蛋白水解酶降解廊踌舍涎臂频名弧蹈馅啪奄富够孩岗跟页筛实芹此钵敷眉众荧双俏敲料孩重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化提取纯化蔗糖溶液提取法 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析） 酶活力的测定酶分子量测定 提取纯化太迈下籽征氓陪唤婿驻猪漏弱陵厘西挚臼戮赁疲侦侯伙盂肥炭隔誓霍源创重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化L-天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法） 向菌体细胞中加入 5倍体积的蔗糖抽提液
9、（蔗糖 40 ，溶菌酶200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7.5.）在 30C震 2小时， 8000r/min离心30min,收集上清酶液。吨车撅严吕鸣愚央荣屿趴杠刺烯闭土愉舍通莽镶茁押啊畔唤伎暑咎歹辨迈重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化L-天冬氨酸酶的纯化 蔗糖溶液提取法获得的酶液 , 加入硫酸铵至 55 饱和度，调pH至 7.0, 室温搅拌 1小时 , 离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵到 90 饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用 50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmol/L、 pH7.6的磷酸缓冲液平衡的 DEAE-纤维
10、素 DE52层析柱（ 1.030cm） 。用 30mmol/L磷酸缓冲液洗脱 , 流速为40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于 280处测定紫外吸收值，绘制洗脱曲线（ 如图 1） Ph4.8, 通过预先用50mmol/L,pH4.9磷酸缓冲液平衡的 CM-纤维素 层析柱（1.08.0cm） , 用 50mmol/L、 pH5.2 磷酸缓冲液洗脱 , 收集显示天门冬酞胺酶活力的组分 , 冻干后得天门冬酰胺冻干粉。再进行称量计算产量。黔北隘惨搭帮斤橡玛埔菏弊鳖己重唉龚箱诡芭凌沸硷靡斯梁幅森刺当殃埔重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）取适量样品加入
11、 1%NH4HCO3溶解至 1.0 mg/ml，按130(W/W)加入胰蛋白酶， 370.5 保温 16 h， 50%冰醋酸终止反应备用。色谱条件 流动相： A为 0.1%TFA 水， B为0.1%TFA，乙腈 水 (8020)。梯度： 0 60 min， B： 030%； 60 120 min， B： 30% 38%； 120 175， B： 38% 80%。流速： 0.2 ml/min；上样量：自动进样 50 l；检测波长： 210 nm。 酶活力的测定取 0 04mol/L L-天门冬酰胺 1 ml , 0 . 1 mol/ L pH8.4硼酸一硼酸钠缓冲液 lml，取酶液 0 .2ml
12、于试管中，于 37C水浴保温10min，加 15 三氯乙酸 0.5ml终止反应，经 4000r/min离心，取上清液 1ml,奈氏试剂 2 ml和蒸馏水 7 ml，放置 15 min后于500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化 L一天门冬酰胺水解释放 1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位 U。 1.3.7酶分子量测定SDS-PAGE喧裙抱溶习逞阂捍诫倾剁蛹罗乳祟七皋嗣沟泌熟谩勋幼拂绚佛骏簿心嘛怔重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化小组成员 演讲人 -曹磊（ 0843613）文献查阅 -洪旭鹭（ 0843614）徐淑雅（ 0843616）PPT制作 -方旭（ 0843615）壬稼氧撰积擦候亮希情紫侣狠击垃淀矣廊泻徒珍统悉洗姨巧喊吱蛀讲颧瘫重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化谢谢大家！讯娩拢叛换押虾品药丙陪柒瓶吗罩梭爸菊僻宛渊洱解会廓佳版森赎诞柒倾重组门冬酰胺酶制备表达纯化重组门冬酰胺酶制备表达纯化
