1、- 1 -实验五 人的外周血淋巴细胞培养一、实验原理外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期( 或 Go 期) ，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。二、实验目的掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。三、实验材料人的外周血。四、实验器具和药品1用具: 2 毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒
2、温培养箱，显微镜。2器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少 2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；1501h。隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15 磅 15min)。3药品(1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末 10.5 克，用 1000ml 的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或 CO2 气体处理，如 pH 值降至 6.0 时，则可溶解而透明。每 1000ml 溶液加NaHCO，1.0 1.2g，以干冰或 CO2 气体校正 pH 至 7.
3、07.2。立即以 5 号或 6 号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。(2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末 160mg(每 mg 含 126U)，用 40ml 的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每 ml 500U。高压消毒 8 磅 15min。(3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素 4mg，用 100ml 生理盐水溶解，用 6 号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱 4保存。使用时用 1ml 注射器吸取该溶液 0。050.1ml 加入 5ml 的培养物中，其最终浓度为 0.40.8ugml。(4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细
4、胞有丝分裂刺激剂。提取 PHA 的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4) ，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加 30ml 生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加 70ml 生理盐水，混合均匀。置冰箱 24h。然后以 3000 转min 离心 15min，取上清液，用生理盐水稀释 10 倍，5 号除菌滤斗过滤，- 2 -分装小瓶，冰冻保存。酒精乙醚提取
5、法：四季豆 50g，先用生理盐水洗净。将豆浸入 60ml 盐水中，保存于 4冰箱内，24h 后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加 140ml 盐水，置 4冰箱中 24h，取出后以 6000 转min 离心20min，吸取上清液，调 pH 至 5.6(用 0.1molL HCl 调) 之后，每 100ml 上清液加 40ml 无水酒精，加以搅拌，以 3000 转min 离心 15min，取上清液，弃去沉淀。在每 100ml 上清液中加 170ml10乙醚无水酒精(10ml 乙醚十 90ml 无水酒精 )以 3000 转min 离心 15min，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气 24d
6、，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以 0.85NaCl 液配成 1的溶液，此 PHA 溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每 5ml 培养物加 0.1ml 即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的 PHA 溶液便无需用细菌滤器过滤。(5)抗菌素青霉素(以每瓶 40 万 U 为例): 以 4ML 生理盐水(或培养基) 稀释，则每 ML 含 10 万 U。取 1ml 加入100ml 培养基中，则最终浓度为 100Uml。链霉素(以每瓶 50 万 U 为例)：以 2ml 生理盐水( 或培养基 )稀释，则每 ml 含 25 万 U。取 0.4ml(
7、含10U)加入 1000ml 培养基中，则每 ml 含 100U(即 100g)。(100 万 U=lg，lg=1106g)。(6)姬姆萨染液：0.5g 姬姆萨粉末，加 33ml 纯甘油，在研钵中研细，放在 56恒温水浴锅中保温90min，再加入 33ml 甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1 ：10 稀释。(7)0.1molL 磷酸缓冲液： pH7.47.6A. Na2HPO412H20 28.8gKH2PO4(无水) 2.67g溶解于 1000ml 双蒸水中。B. Na2HPO47H20 2.164gNaH2PO42H20 0.3g
8、溶解于 1000ml 双蒸水中。五、实验步骤1培养液的分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为：培养液(RPMIl640 或 M199) 4ml小牛血清 lmlPHA 0.2ml肝素 0.05ml双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100Uml用 3.5NaHCO 3 调 pH 到 7.27.4，分装到 20ml 的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于 0条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入 37恒温锅中温育 10min。2采血：用 2ml 灭菌注射器吸取肝素(500Uml)0.05ml 湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约 0.3ml，在酒精
9、灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内 (内含有生长培养基 5ml)接种，轻轻摇动几次，直立置 370.5恒温箱内培养。 3培养：置 37温箱内培养 6672h。4秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为 40gml 的秋水仙素 0.050.lml，最终浓度为 0.40.8gml，置温箱中处理 24h。5低渗处理：低渗液的种类较多，如 0.075molL 的 KCl 溶液，0.95的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释 4 倍的 Hanks 液，也可直接用蒸馏水。秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液 5 毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管-
10、 3 -中置 37温箱内处理 20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。6离心: 以每 1000rpm/min，离心 5min，弃去上清液，收集白细胞。7固定：固定液为甲醇：冰醋酸：3：1。每只离心管中，加入固定液 24ml ，片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定 15min 后，离心，吸弃上清液，留下白细胞。8再固定：加入固定液 2ml，用吸管轻轻打散，室温下继续固定 15min(过夜也可以) 。9再离心：除去上清液，留下白细胞制片。10制片: 向上述离心管中滴入固定液 0.5 毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液 13 滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹
11、干，或在酒精灯火焰上微微烤干。11染色：用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释后的姬姆萨染色液染色 20min，然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。12镜检：待稍午后，在显维镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。13. 封片： 用加拿大树胶封片。选择染色体清晰，分散度好 的细胞进行显微摄影，进行核型分析(见图 201)。图 20-1 人体外周血培养与染色体标本制作示意图- 4 -六、实验注意事项1接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后 24h 内进行培养，如果不能立刻培养，应置于 4存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。2在培养中成败的关键，除了至为重要的 PHA 的效价外，培养的温
12、度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为 37+0.5。培养液的最适 pH7.27.4。3培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开，继续放回 37恒温箱内培养。4制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开；可将固定时间延长数小时或过夜。七、实验结果1 核型分析：人类每个体细胞有 46 条染色体，22 对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY 女子是 46，XX(见图 202)。图 20-2 人淋巴细胞染色体(46, XY)求取以下三个参数：(1) 染色体的相对长度= 染 色 体 长 度条条 常 染 色 体 总 长单 个 染 色 体 长 度 X120（2）臂比率= 短 臂 长 度长 臂 长 度- 5 -（3）着丝粒指数= 10染 色 体 全 长短 臂 长 度可以将人的 46 条染色体分成 A、B、C、D、E、F、G 七组，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。参考文献项维，吕曼硎，7(1963)， 科学通报 ，科学出版社，北京。- 6 -
