1、长春中医药大学2009届硕士学位论文ABSTRACT英文摘要【Objective】 The research was To observe effects of Xiaxi granules on bloodpressure and MMP-1、PIIINP in serum of spontaneously hypertensive rats ,and toinvestigate the effects on left ventricular and its mechanism.【Methods】 All the 12-week-old SHR were assigned randomly
2、into 5 groups, 10 perset: the group treated with Valsartan (the positive control group ), the blank controlgroups, the other three groups treated with different doses of Xiaxi granules recipe. 8Normal Wistar-Kyoto (WKY)-rats were used as control group .After 8-week-treatments,By using SHR blood pres
3、sure measuring machine and several biochemical techniques,systolic blood pressure（SBP）, MMP-1 、PIIINP concentration in serum，left ventricularmass index（LVMI ）were measured.【Results】 Compared with the blank control groups ,the degree of the improvement ofblood pressure, LVMI and MMP-1、PIIINP concentr
4、ation in serum of the therapy groupwas better than that of the control group significantly (p0.05).【Conclusions 】 Xiaxi granules can reduce hypertension evidently. The high dose groupwas evident. Xiaxi granules can preserve and reverse left ventricular hypertrophy , Itsmechanism may be related to mo
5、dify MMP-1、PIIINP in serum and it is worthconsidering as a promising Chinese material medica for the treatment of hypertension.【Keywords】 Xiaxi Granules spontaneously hypertensive ratsMMP-1PIIINP2LVH长春中医药大学2009届硕士学位论文前言前言高血压（hypertension）是一种以体循环动脉压升高为特点，由基因遗传、环境及多种危险因素相互作用所致的全身性疾病。其中原发性高血压（essential
6、hypertension，EH，即高血压病）占 95%以上。高血压是心脑血管疾病的重要危险因素，严重威胁人类健康。WHO 高血压专家委员会指出 “高血压是一个群众性健康问题，在许多国家影响大约 20%的成年人”。冠心病的发病率和死亡率随血压水平的升高而增加，整个人群的血压水平与冠心病发生危险呈一连续线性关系。舒张压长期增高 5-6mmHg，冠心病危险性增加 20-25%，舒张压大于 110mmHg 患冠心病的危险是舒张压小于 80mmHg 的 5-6 倍。高血压也是脑卒中首要危险因素，高血压患者发生脑卒中比正常血压者高 6 倍。肾脏是高血压病损伤的直接靶器官，高血压肾脏并发症发生率为 42，仅
7、次于心脏并发症，其中约 10%死于肾衰。我国高血压患者11000 万，近 10 年以每年 350 万人增长，具有发病率、致残率及死亡率高，控制率、服药率及知晓率低的特点。国内外研究表明收缩压每降低 10-14mmHg，舒张压每降低 4mmHg，脑卒中危险减少 40，冠心病危险减少 16.7，人群心血管事件减少33.3 %。高血压病的防治已成为本世纪医学界的一个重要问题。中药复方治疗高血压病，不仅仅是每一味中药作用的简单相加；它是通过多途径、多靶点的整合调节，发挥降压作用。降压特点是作用缓和，与化学药物相比，副作用相对小，适合长期服用；而且由于中药复方本身的多组分特点，在其发挥降压作用的同时，有
8、效地调整着高血压水平所导致的其它系统的失衡状态。具有改善微循环、降脂抗氧化、保护内皮，调节血管活性物质、血液动力学、血液流变学、血管疏缩功能等的异常，调整血液中的纤溶系统功能、血小板功能，纠正多种物质代谢紊乱的作用，还能有效防止使用西药产生的副作用，明显改善高血压病的临床症状，提高患者的生活质量，且对心、脑、肾等靶器官的调节和保护方面具有独特的优势。因此中医药治疗高血压有着广泛的研究前景。夏膝颗粒是导师在临床应用多年的治疗原发性高血压的常用方剂，在临床应用过程中发现其对高血压患者血压及症状的改善有一定作用，本实验即是通过观察中药夏膝颗粒对自发性高血压大鼠的降压作用基础上通过检测血清 MMP-1
9、、 PIIINP 的浓度，对该药的作用机理作以进一步探讨，为扩展其临床应用范围及开发新药提供实验依据。3长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景第一部分研究背景MMP-1、PIIINP 与高血压左室肥厚1细胞外基质（extracellular matrix，ECM）1.1细胞外基质定义：细胞的增殖、分化及功能的正常发挥均依赖于细胞外环境中各种分子的作用。这些分子包括各种生物因子、分化因子、细胞粘附分子和细胞外基质成分【1,2】。其中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形
10、状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。1.2细胞外基质分类及其生物学特性：目前被研究的 ECM达 40余种，大致可把它们分成四大类 :胶原蛋白(collagen ):迄今在哺乳动物的组织和细胞培养中已发现至少 19种胶原蛋白(collagenIcollagen X)，是 ECM的主要组成成分【3】。其中胶原蛋白 IV主要存在于基底膜中，同时也是基底膜的主要胶原成分。蛋白多糖亦称蛋白聚糖(proteoglycan, PG):大多数 PG分布于其他 ECM中，近年来在细胞表面、细胞膜中、细胞浆、细胞核中亦发现有 PG的存在，包括硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、透明质酸等。弹性蛋白(elastin ):是弹性
11、纤维(elastin fibre)的主要蛋白质成分，存在于许多组织细胞外基质中。该大分子是体内最不易溶解的蛋白。细胞外间质糖蛋白:目前已发现的 ECM糖蛋白有十余种，其中纤维连接蛋白和层连接蛋白是糖蛋白中研究的最多的两种分子。除此之外，ECM还存在一些可溶性成分，主要有与基质代谢相关的蛋白酶和与基质相结合的细胞因子。与基质代谢相关的蛋白酶主要包括:MMPs及其特异性抑制剂 TIMPs ;丝氨酸蛋白酶及其特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin ):其中丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶 (trypsin )、胰凝乳蛋白酶 ( chymotrypsin )、凝血酶( thrombin)、纤溶酶 ( plas
12、min )、弹性蛋白酶(elas-tale )、尿激酶型(uPA)和组织型(tPA)纤溶酶原激活因子等。与基质结合的细胞因子主要有:TGF一 l, TGF一2, PDGF,FGF, IL一 1,2,3,4,6,IFN,HGF, oncostatinM等等。ECM不仅对组织细胞起物理机械性的支持作用，而且这些大分子物质可与细4。尽管 MMPs 的来源、分布和功能有所不同，但都：长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景胞表面上的特异性受体结合，调节细胞的极性、运动性和基因表达等细胞行为，参与细胞胚胎的发生发展【4】，组织细胞的生长分化，对组织创伤修复和纤维化，细胞的衰老和癌变 【 5 6】
13、等过程有调控作用。1.3参与细胞外基质的降解的蛋白酶：降解 ECM的蛋白酶可分为 4大类【7】：(1)丝氨酸蛋白酶类，能降解多种结构性糖蛋白，并对 MMP有激活作用。(2)半胱氨酸蛋白酶类，具有降解胶原及激活胶原酶的作用。(3)天冬氨酸蛋白酶。(4)基质金属蛋白酶(matrix metalloprotenase, MMP)：是分解细胞外基质的蛋白酶类中最重要的一类,含有锌原子，其活性依赖于钙离子，直接以酶原的形式分泌到细胞外基质中，并在正常生理条件下发挥作用，它的表达及调控受到严格的控制，它是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶,【8】它们存在于正常人体，参与伤口愈合、骨吸收、妊娠分娩、乳腺
14、复旧等过程。自 80年代初研究该酶类，到 Cossins等【9】1996年发现并命名 MMP-18以来，发现它们参与多种病理过程，包括血管再生、肿瘤浸润及转移、炎症反应等。2基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)2.1基质金属蛋白酶的共同特点【10】：MMPs是一组内源性锌(Zn2+)依赖蛋白酶家族，在心脏主要由成纤维样细胞、炎性细胞和心肌细胞产生 【 11 12】具有以下共同特点:(1) 至少可以降解一种 ECM成分 ;(2)通常以酶前体一抑制物复合物形式分泌到细胞外，需进一步激活才具有蛋白水解活性;(3)催化区均含 Zn2+维持其活性;(4)需钙 (C
15、a2+)维持其稳定性;(5)其活性可以被金属离子鳌和剂如 EDTA抑制;(6)中性 pH值环境保持活性;(7) 所有 MMPs的活性均可被相应的 TIMPs所抑制。2.2 MMPs的活性调节 【13】机体内 MMPs的活性至少受 5种形式的调节，包括转录水平的调节、潜酶活化、特异性抑制因子、其他抑制因子和负反馈调节。 MMPs的转录调节：MMPs的 mRNA受到各种化学因素、神经内分泌、细胞因子及细胞骨架结构、基膜粘附性的影响。许多生长因子和细胞因子如白介素 1(IL-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF- a)可以使 MMPs的转录增加;儿茶酚胺、血管紧张素 II (A
16、ng-II)、内皮素会通过受体使心肌内许多细胞蛋白5长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景激酶 C (PKC)增高，使 MMPs升高;而转移生长因子(TGF- )、肝素、考的松等可抑制 MMPs的合成。 MMPs的潜酶活化：MMPs潜酶形成分泌，其活性的封闭是由于在其锌离子活性中心的旁边结合有该 MMP前区肽链内所含的一个半胱氨酸，该半胱氨酸阻断了活性中心与底物的结合所致。MMPs 的活化过程，是将 MMPs的前区肤劈开，使半胱氨酸与锌离子分离，从而暴露出锌离子活性中心。血浆纤溶酶和间充质溶解素是已知的生理性 MMPs激活因子。血浆纤溶酶由血浆纤溶酶原在尿激酶型(uPA)或组织型(tP
17、A)纤溶酶原激活因子的作用下激活而来，因此，丝氨酸蛋白酶在 MMPs的活化中起有决定性作用【14】。金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)：抑制因子家族是一个多基因家族的编码蛋白。包括 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4。以 1: 1的克分子比例与 MMPs结合形成 MMP-TIMP的复合体，从而阻断 MMPs与底物结合，形成体内的内生性抑制系统【15】。基质金属蛋白酶 TIMP-1分子量为 28. 5KD，可以与活化的间质胶原酶、基质蛋白酶和 MMP-8形成 1:1复合体。TIMP-2分子量为 21 KD，以 1:1的非共价键形式与活化的 MMP-2形成复合物，可抑制
18、其溶解胶原和明胶的活性。TIMP-2 与无活性和激活的 MMP-2均能结合，并可终止金属蛋白酶家族所有成员的水解活性。另外研究显示，TIMP-1和 TIMP-2对培养的成纤维细胞的生长呈剂量依赖性刺激作用。TIMP-3分子量为 21 KD，只存在于 ECM中。TIMP-4 唯一高表达的器官是心肌，其半衰期约为 60h，但尚不明确，在心肌中 TIMP-4是否具有不同的 MMP抑制活性尚待探讨。其他抑制因子：血浆中的 a2巨球蛋白是一种非特异性蛋白酶抑制因子，能抑制MMPs的活性。此外，某些人工合成的含硫多肽衍生物，甚至半胱氨酸的非肽衍生物也能与 MMPs的锌离子活性中心结合，抑制 MMPs的活性
19、【16】。负反馈调节：纤溶酶一方面激活 MMPs，引起 ECM降解，另一方面又诱导产生纤溶酶原激活抑制因子一 1，使纤溶酶的产生受限，从而使纤溶酶原激活不至于过度。纤溶酶诱导产生纤溶酶原激活抑制因子一 1的机制较复杂，可能系由于 ECM降解降解产物引起的受体调节所致【17】。3高血压左室肥厚与 MMP-1、PIIINP左室肥厚是高血压病常见的靶器官损害。也是增加原发性高血压患者病残率和病死率的一个重要的独立危险因素。其病理改变主要包括两个方面:一是心肌细胞6长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景的增生与肥大，二是心肌细胞外基质重构。高血压心肌重构不但使心室硬度增加，心脏功能减退，还可导
20、致心室功能不全、冠脉储备不全和严重的室性心律失常，使高血压患者发生心力衰竭和碎死的危险显著增加。因而防止与逆转高血压心肌重构已是目前治疗高血压的重要目的之一。近年来，国内外学者在高血压心肌重构方面进行了一定的基础和临床研究，但高血压心肌重构的发生机制、早期诊断和治疗措施，仍处在探索中，深入研究其发生机制，探讨阻断它的发病途径无疑对高血压心肌重构的诊治具有重要意义【18】。3.1心肌胶原的合成与PIIINP：近年来的研究还表明，高血压病 LVH 时，不仅有心肌细胞的肥大，而且伴有心肌间质细胞的增生及胶原纤维的异常堆积，导致心肌纤维化的发生，主要表现在心肌间质原有胶原增粗，新胶原沉积于原来缺乏的心
21、肌间质内，胶原体积比例增加。心肌间质胶原有多种类型，其中 85是型胶原，11为 III 型胶原，其它为、型等胶原。胶原与其他蛋白质一样，在细胞内经 DNA转录为 mRNA，再翻译表达为前胶原肽。前胶原的氨基端与羧基端各有一非胶原性端肽，前胶原分子在羟化以后，形成三股螺旋，并进行糖化后，即由细胞内向细胞外分泌。在细胞外，三股螺旋的 2个端肽氨基端肽与羧基端肽将被肽酶切去，仅留下具有三股螺旋部分的胶原分子，心肌成纤维细胞是分泌胶原的主要细胞，因此，血清 III型前胶原氨基端肽（P IIINP）能较为准确地反映心脏组织胶原合成的活跃程度、是反映高血压病病人心肌胶原合成活跃程度、左心室肥大的敏感指标【
22、19】。基质金属蛋白酶家族(MMPs) 为 ECM 降解的限速酶，能特异性分解 ECM，其对胶原的沉积和组织结构的改建起着重要作用。基质金属蛋白酶 1(MMP-1)的主要底物是 I、III 型胶原【20】。3.2心肌胶原的降解与MMP1：心肌胶原的降解主要受心肌基质金属蛋白酶类(MMPs)及其抑制物(TIMPs)的调控。MMPs 主要由结缔组织分泌，参与细胞外基质(ECM)的降解，是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分，其活性受金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的抑制，二者涉及到正常组织的重塑、创伤愈合、肿瘤转移等广泛的生物学过程。其中 MMP1 为一种间质胶原酶
23、，是 MMPs 家族中最为特殊的一种酶，同时也是启动胶原降解的唯一酶 【 21】 。它可以在单一位点分解 I，II ,III 型胶原稳定、致密的三股螺旋分子结构，使其解螺旋、断裂成胶原片段，之后再被明胶酶继续降解。在高血压病人中，MMP-1浓度降低，而 TIMP-1浓度增高。MMP-17。其中 TIMP1 为一种相对分子质量为 28500 的糖未发现肥厚与不肥厚者之间有血清 TIMP-1 水平明显差异，由长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景的活性减弱，使间质胶原浓度增加，降解减少，导致血管周围胶原积聚、纤维化;通过治疗，高血压病人血压恢复正常，同时胶原降解正常化【22】。金属蛋白酶组
24、织抑制剂(TIMPs)是阻断细胞外基质降解，抑制金属蛋白酶活性的一组分泌糖蛋白，它参与组织结构的建立和维持，可间接影响依赖 ECM 的细胞信号的传递，目前己确认的 TIMPs 家族 4 个相关的蛋白，包括 TIMP1, 2, 3, 4。 TIMP 主要从两个方面抑制 MMP 的激活:(1)在酶原活化阶段:TIMP 与 pro MMP 可形成稳定的复合体，并阻碍pro MMP 的酶原自我激活。(2)在活化的 MMP 阶段:TIMP 可直接与活化的 MMP 形成紧密的 1:1 复合体，抑制其活性 【23】蛋白，它可以优先抑制 MMP1【24】，是 MMPs 活性的主要调节者，控制着多数的 MMPs
25、。MMPs-TIMPs的平衡对维持胶原的正常代谢有重要作用。简言之，高血压心肌重构的发生是一个由众多生物活性因子参与并共同调节的过程，是胶原生成大于降解的结果【25】。因此，抑制心肌胶原的合成并促进其降解是预防与逆转高血压心肌重构，改善心功能的关键环节【26】。3.3 MMP-1， TIMP-1与高血压左室肥厚的相关报道：Lav C 等报告【27】高血压病人血清 MMP-1水平下降，血清 TIMP1浓度增高，说明高血压患者存在 MMP-1和 TIMP1血清水平的异常，血清 MMP-1和 TIMP1水平变化说明高血压患者心肌细胞外纤维降解能力下降。Lav等报告【28】高血压心肌肥厚组血清 MMP
26、-1水平明显低于不肥厚组，即高血压病人 MMP-1活性降低在心肌肥厚者更明显。 Li-Saw-Hee等 【29】于 MMP-1和 MMP-9均能被 TIMP-1阻止，所以理论上应该有差别。M. MitchellLindsay等【30】和 TimmsPM等【31】试验均发现室肥厚组 TIMP-1水平明显高于不肥厚组。所以血清 TIMP-1的水平更能反映高血压细胞外胶原降解的情况，并能反映纤维化的轻重。M. Mitchell Lindsay等还对 100例高血压患者进行心脏彩色多普勒心室舒张功能的检查，发现当血浆 TIMP-1水平大于 500 ng.mL-1时预测舒张功能的特异性为 97%，阳性预
27、测率为 96%，认为血浆 TIMP-1水平可以作为预测左室舒张功能的一个无创性指标。 Sasamura H【 32】 等对高血压病患者用血管紧张素受体阻滞剂 (angiotensinreceptorblockers , ARBs)坎地沙坦西酯治疗观察其临床疗效，用药前后测定胶原合成和降解的标志物 I型胶原蛋白(procollagen type I propeptide , PIP), III型胶原蛋白8长春中医药大学2009届硕士学位论文 研究背景(procollagentype III propeptide，PIIIP), MMP-3, TIMP-3，服药一年后发现血压和心率恢复正常的同时
28、III型胶原蛋白(PIMP)降低而血浆 MMP-3增加，而且脉搏速度的变化与 MMP-3的水平有关，此治疗证明高血压病人 ECM代谢的变化及其与 RAS的关系，同时也进一步证实了高血压病人血浆 MMP-3降低的事实。Laviades等【31】对 37例高血压病人，23例正常对照组进行血清 I型胶原降解片段(CITP)、MMP1 及 TIMP 1的浓度测定。与正常对照组相比，高血压病人组 MMP-1浓度降低(P0.05）,说明低剂量组药物无效（表 2）。18长春中医药大学2009届硕士学位论文 实验研究表 2 药物对大鼠左室肥厚指数的影响（单位 mg/g， xS）组 别 n LVW（ mg） B
29、W（g） LVW/ BW（mg/g）WKY对照组SHR空白组阳性药组夏膝高剂量组夏膝中剂量组夏膝低剂量组81010989237.845.08376.257.1*309.451.76*304.739.97*301.449.7*361.338.7*3059.74310.97.843103.9309.212.030611.4310.911.90.7810.151.210.19*1.00.14*0.990.14*0.980.15*1.160.13*注：与 WKY对照组比较，*P0.05 ），但夏膝颗粒中、低剂量组与 WKY对照组比较有显著性差异（P0.05），但夏膝颗粒中、低剂量组与WKY对照组比较有
30、显著性差异（P0.05），说明夏膝颗粒高剂量组与缬沙坦组在降低血清PIIINP 浓度方面作用相似。（5）SHR血清MMP-1 浓度明显低于WKY 组，证明细胞外基质金属蛋白酶在胶原蛋白降解平衡中的重要作用，缬沙坦组和夏膝颗粒高剂量组与WKY组比较无明显差异（P0.05），说明夏膝颗粒高剂量组与缬沙坦组在调整血清MMP-1浓度方面作用相似。同时说明夏膝颗粒具有调节胶原合成和降解平衡的作用。8 结论夏膝颗粒对SHR降压疗效确切，并有预防或减轻SHR左室肥厚的作用，初步考虑其作用机制与改善血清MMP-1和PIIINP的浓度有关，是一种极具研究价值及应用前景的中药制剂。25长春中医药大学2009届硕士
31、学位论文致谢致谢衷心感谢导师黄永生教授在本课题的选题、设计、实施、总结和论文撰写的各个环节给予我的悉心指导、全力支持和热心的鼓励。衷心感谢恩师三年来在我的学业、工作和生活上给予的谆谆教诲和热心关怀。恩师渊博的专业知识，严谨的治学精神，高尚的医德医风和人格魅力将永远激励着我。在此谨向我的导师致以最衷心的感谢和最崇高的敬意!衷心感谢吉林中医中药研究院新药中心徐慧波教授、药理科主任焦连庆教授、吉林大学分子生物学实验室关树文副教授、吉林大学病理科张丽红教授、长春中医药大学于兰英教授、于宏教授等的大力支持和帮助。在此一并表示感谢！26长春中医药大学2009届硕士学位论文 参考文献参考文献1 MMPs_T
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