1、引 言腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation，LDH）是因腰椎间盘退行性变或外伤导致纤维环破裂，髓核突出刺激和(或)压迫神经根所表现的一种综合症，是引起腰腿痛最常见的原因之一1。腰椎间盘突出症的治疗方法多种多样，20世纪 90年代起，国内外运用医用臭氧介入治疗椎间盘突出症并取得了满意效果。国内外研究2-6结果表明医用臭氧治疗腰椎间盘突出症的机理主要有氧化作用、抗炎作用和镇痛作用，目前认为其氧化作用是医用臭氧介入治疗椎间盘突出症的主要机制。臭氧对椎间盘髓核的氧化作用主要特征是使髓核中蛋白多糖脱水，出现胶原纤维细胞衰退、变形甚至坏死等现象，并有可能使突出的椎间盘组织回缩。突出
2、的椎间盘髓核减小或回缩能减少对神经根的压迫，同时也能减少静脉淤血。治疗后最理想的情况是出现突出椎间盘组织缩小乃至回缩。但这种理想情况发生率各家报道不一7-9。我们在临床发现大部分经臭氧治疗术后效果良好的患者，一个月复查 CT却未发现明显突出椎间盘的回缩，一方面证明臭氧氧化髓核组织是一个缓慢的过程，另一方面证明解除神经根机械压迫并不是臭氧治疗的全部作用机理。迄今，对医用臭氧治疗腰椎间盘突出症的机理的氧化作用、抗炎作用和镇痛作用研究较多，但对医用臭氧介入治疗腰椎间盘突出症对其自身免疫作用影响的研究国内外尚未见报道。研究表明10-15腰椎间盘突出症患者存在自身免疫状态的异常，腰椎间盘突出症患者的血清
3、、脑脊液和突出髓核中，IgG和 IgM含量较正常人显著升高。椎间盘突出髓核中，Th1细胞因子优势应答。椎间盘突出血清和髓核中 TNF-、IL-6 、IL-10、IL-12等细胞因子含量较正常人升高、T淋巴细胞亚群较正常人显著降低。本课题通过观察医用臭氧介入治疗腰椎间盘突出症患者术前、术后三天、术后一月血清中 IgG、IgM、TNF-、IL-6 、IL-10、IL-12水平的变化，进一步研究腰椎间盘突出症的自身免疫机制，探讨医用臭氧介入治疗腰椎间盘突出症可能的免疫作用机理。11.材料与方法1.1一般材料随机选取自 2006.6-2008.8符合纳入标准 60例患者，男 38例，女 22例；年龄
4、27-68岁，平均年龄 42.5岁，平均病程 2年。36例患者临床表现为腰痛合并一侧或双侧下肢放射性疼痛、麻木；24例仅表现为下肢疼痛、麻木；其中单一节段（L4-L 5或 L5-S1）椎间盘突出症患者 29例，1例患者 L4-5椎间盘突出合并同平面椎管明显狭窄；31例患者 L4-L5合并 L5-S1突出；所有患者均经过至少 8周保守治疗无效。经 CT或 MRI扫描证实 60例患者均有与临床定位体征相符的腰椎间盘突出。对照组随机选取同期在我院行体检 60例健康成年人，男 36例，女 24例；年龄 28-65岁，平均年龄 41岁。医用臭氧治疗腰椎间盘突出症的适应症：1下腰痛和坐骨神经痛，无严重神经
5、功能丧失。2保守治疗至少 8-12周以上无效者。3CT和 MRI检查显示为椎间盘突出，与临床定位症状一致，且临床症状与腰椎退性改变关系不大者。4外科手术治疗后出现腰椎间盘术后综合症者。医用臭氧治疗腰椎间盘突出症的纳入标准：1临床症状和体征、腰椎平片、CT和 MRI诊断符合臭氧注射治疗适应症。2近期及手术前后均未使用过肾上腺皮质类激素和免疫抑制剂类药物史。3患者知情同意参与，且收集了其完备的临床指标。医用臭氧治疗腰椎间盘突出症的排除标准：1合并自身免疫性疾病、血液淋巴系统疾病、恶性肿瘤、肝肾疾病及急慢性传染病的患者。2患者合并甲亢、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症及蚕豆病、出血倾向等。3妊娠或哺乳期
6、妇女。1.2主要仪器和设备1.2.1臭氧注射治疗腰椎间盘突出症所用仪器和设备臭氧发生器(德国赫尔曼) ；CT扫描仪(SIMENS公司)；小型 C臂透视机(东华电子)；21G针或酒精穿刺针；瓶装医用纯氧1.2.2检验试剂和设备DLZ4-0.8平衡微量离心机 (北京医疗离心机厂)；2Olympus Au560全自动生化分析仪(日本)；酶联免疫检测仪（E2500型，美国 Bio-Rad）免疫球蛋白免疫透射比浊法检测试剂盒(四川迈克有限责任公司提供)。生产标准号：Q/20186004-X EL07-2003。附：试剂盒成份检测试剂 IgG、IgM免疫球蛋白校准血清羊抗人 IgG、IgM血清定值见标签消
7、脂剂TNF-试剂盒( 深圳晶美公司):批号:FRK0013IL-12试剂盒(Bender Medsystems公司): 批号:BMS640IL-6 试剂盒(Bender Medsystems公司): 批号:BNS740IL-10试剂盒(Bender Medsystems公司): 批号:BGM5401.3治疗方法1.3.1手术方法患者取俯卧位，下腹垫软枕。通常取脊柱中线旁开 8-10cm处为穿刺点,常规消毒铺单，铺洞巾。2%利多卡因局麻。用 21G多侧孔酒精注射针行侧后方入路穿刺。术中 32例用 C型臂定位明确进针点，按针尖与皮肤呈 45进针，经安全三角区顺利进到 L4/5，L 5/S1椎间隙。
8、图 1.13安全三角区图 1.2 穿刺前 C 型 X 光机定位 图 1.3 术中穿刺图 1.4 C 型臂透视下穿刺成功，穿刺针位于中后 1/3 间隙14例用 CT定点定向，在 CT引导下穿刺进针，针尖位于椎间隙中后 1/3区域。图 1.5 术前在 CT 上定点定位4图 1.6CT 扫描位于椎体中后 1/3图 1.7 注入臭氧 图 1.8 拔针,CT显示气体分布将臭氧发生器与医用纯氧氧气瓶连接，设定输出混合气体臭氧浓度为 60ug/ml，向病变椎间盘注射浓度为 60ug/ml的臭氧气体 20ml，退针至椎间孔附近时，再向椎旁组织注射浓度为 40ug/ml的臭氧 10-15ml。拔针，术毕。1.3
9、.2血浆球蛋白 IgG、 IgM的收集和测定于术前、术后三天空腹静脉采血样 3ml置于 EDTA抗凝管中，在 15分钟内离心，1000prm，收集上清液封闭于 Ep管内-80冰箱保存待检。IgG、IgM 的测定用免疫透射比浊法：运用免疫透射比浊法检测人血清中免疫球蛋白 IgG、IgM的含量，人血清中免疫球蛋白 IgG、IgM与其相应抗体在溶液中相遇，形成抗原-抗体复合物，形成一定浊度，该浊度高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下，通过与同样处理的校准液对照，定量检测出样品中免疫球蛋白 IgG、IgM的含量。测定步骤（1）操作：将校准血清用生理盐水作 2.5倍、5倍、10倍稀释成
10、三个不同浓度，按下表操作：（ul） IgG IgMU Ci B U Ci B10倍预稀释样品校准血清生理盐水3-3-310-10-10试剂 R 300 300 300 300 300 300注：Ci：i 从 1 到 3，表示稀释成 2.5 倍、5 倍、10 倍三个不同浓度，U ：样品管 B：空白管 C：校准管混匀，37孵育 10分钟，340nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。5（2）计算：使用多点半对数校准模式，由仪器自动生成校准曲线后根据吸光度读取样品中免疫球蛋白含量。1.3.3 TNF-、IL-6、IL-10、IL-12收集和测定于术前、术后三天、术后一月空腹静脉采血样 3ml置于 E
11、DTA抗凝管中，在 15分钟内离心，1000prm，收集上清液封闭于 Ep管内-80冰箱保存待检。按酶联免疫吸附法(ELISA)操作方法检测血清中 TNF-、IL-6、IL-10、IL-12 的含量。酶联免疫吸附法(ELISA) IL-6 操作步骤：检测前准备：1提前 20分钟从 4冰箱中取出试剂盒。2浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：20）3标准品分别稀释为以下浓度：4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml。4生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1：100）,临用前 15分钟配好。5酶结合工作液：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结
12、合物（1：100）,临用前 15分钟配好。操作步骤：1从平衡至室温的密封袋中取出所需板条。2除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（100ul/孔）加入相应孔中；用封板纸封住反应孔，37孵育 90分钟。3洗板 4次,手工洗板,甩尽孔内液体。每孔加洗涤液 300ul，静置 30s后甩尽液体。吸水纸上拍干，洗 5次。4除空白孔外,加入 IL-6 生物素化抗体工作液（一抗）（ 100ul/孔）封板，37孵育60分钟。5洗板 4次。6除空白孔外,加入酶结合物工作液（100ul/孔），封板，37孵育 30分钟。7洗板 4次。8加显色剂（100ul/孔）,避光 37孵育 45分钟。9发现部分孔已变蓝后,加
13、入终止液（100ul/孔），溶液颜色变黄。10立即混匀后在酶标仪上测 OD值（5分钟内），酶标仪主波长 450nm，辅助波长630nm。11手工绘制标准曲线，标准品浓度为横坐标，OD值作为纵坐标，以平滑线连接各标准品坐标点、依此曲线查出样本 OD值所对应的 IL-6的浓度。6白细胞介素含量(pg/mL)12IL-10、IL-12、TNF-的检测除步骤 4所加入的一抗为 IL-10、IL-12、TNF-生物素化抗体工作液，余步骤与 IL-6的检测步骤相同。1.4统计学方法用 SPSS10.0统计软件进行分析处理。实验数据用均数加减标准差(xs)表示，治疗前后比较采用 t检验；p0.05统计有显著
14、性差异。2.结果2. 1两组治疗前后血清 Th2型细胞因子 IL-10、IL-6比较与对照组比较，实验组治疗前血清 IL-10、IL-6 水平均升高（ p0.01）；与实验组治疗前比较，实验组治疗后血清 IL-10、 IL-6水平升高（ p0.01）；与实验组治疗后三天比较，实验组治疗后一月血清 IL-10水平升高（ p0.05）；血清 IL-6水平无显著性差异（p0.05 ）。图 2.1两组治疗前后血清 IL-10比较（xs）组别对照组（A）实验组治疗前(B1)实验组治疗后三天(B2)实验组治疗后一月(B3)IL-10(pg/ml)10.261.5211.831.3614.661.2717.
15、281.38IL-6 (ng/ml)106.3426.28128.7622.06130.6523.37131.3621.13IL-10： B1与 A比较，t=6.032， p0.01；B2 与 B1组间比较， t=3.765，p0.05； B3与 B1组间比较，t=4.983，p0.01；B3与 B2组间比较，t=2.983，p0.05IL-6：B1与 A比较，t=4.586 ，p0.01；B2与 B1组间比较，t=3.198，p0.01 ；B3 与 B1组间比较，t=3.265，p0.01；B3与 B2组间比较，t=0. 863，p0.05 ；20151050AIL-10图 2.1两组治疗前
16、后血清 IL-10比较（ xs）7AB1B2B3白细胞介素含量(ng/mL)肿瘤坏死因子含量(ng/mL)200150100500 AAB1B2B3IL-6图 2.2两组治疗前后血清 IL-6比较（ xs）2. 2两组治疗前后血清 Th1型细胞因子 TNF-、IL-12比较与对照组比较，实验组治疗前血清 TNF-、IL-12水平均升高（p0.01）；与实验组治疗前比较，实验组治疗后血清 TNF-、IL-12水平降低（p0.01）；与实验组治疗后三天比较，实验组治疗后一月血清 TNF-、IL-12水平降低（p0.05）。表 2.3对照组、实验组治疗前后血清 TNF-、IL-12比较（xs ）组别
17、对照组（A）实验组治疗前(B1)实验组治疗后三天(B2)实验组治疗后一月(B3)TNF-(ng/ml)1.120.381.860.501.200.421.080.36IL-12(pg/ml)10.540. 8214.760. 6312.240. 7310.380.76TNF-：B1 与 A比较，t=9.565，p0.01；B2与 B1组间比较，t=3.854，p0.01 ；B3与 B1组间比较，t=4.942，p0.01；B3与 B2组间比较，t=3.635，p0.05IL-12： B1与 A比较，t=7.365， p0.01；B2 与 B1组间比较， t=6.846，p0.01；B3 与 B
18、1组间比较，t=7.895，p0.01；B3与 B2组间比较，t=3.630，p0.052.521.510.50ATNF-图2.3对照组、实验组治疗前后血清 TNF-（ xs）8AB1B2B3白细胞介素含量(pg/mL)免疫球蛋白含量(ng/mL)20151050 AAB1B2B3IL-12表 2.4对照组、实验组治疗前后血清 IL-12比较（ xs）2.3两组治疗前后血清 IgG、IgM 比较与对照组比较，实验组治疗前血清 IgG、IgM水平升高（p0.01）；与实验组治疗前比较，实验组治疗后血清 IgG、IgM水平均降低（p0.01）；与实验组治疗后三天比较，实验组治疗后一月血清 IgG、
19、IgM水平降低（p0.05）。表 2.5对照组、实验组治疗前后血清 IgG、IgM比较（xs）组别对照组（A）实验组治疗前(B1)实验组治疗后三天(B2)实验组治疗后一月(B3)IgG (g/L)13.502.8015.922.3611.292.4710.062.38IgM(g/L)0.950.331.680.501.560.361.340.30IgG：B1与 A比较，t=2.463，p0.01；B2与 B1组间比较，t=6.357，p0.01 ；B3 与 B2组间比较，t=2.386，p0.05IgM：B1与 A比较，t=3.480，p0.01；B2与 B1组间比较，t=11.478，p0.
20、01；B3 与 B2组间比较，t=2.587，p0.0520151050 AAB1B2B3IgG IgM表 2.5对照组、实验组治疗前后血清 IgG、 IgM比较（ xs）93.讨论3.1腰椎间盘突出症患者机体自身免疫反应正常椎间盘位于由上下软骨终板和纤维环包围而成的一个相对密闭系统内，三者共同构成椎间盘弹性缓冲系统。椎间盘髓核是体内最大的、无血管的封闭结构组织，其营养主要来自软骨终板的弥散作用，被排除在机体免疫机制之外。当椎间盘受到损伤后，髓核即突破纤维环或后纵韧带的包围，在修复过程中新生血管长入髓核组织，髓核与机体免疫机制发生密切接触，髓核基质里的糖蛋白和蛋白便成为抗原，持续的刺激机体的免
21、疫系统，诱发自身免疫反应16。自身免疫的病程损伤包括自身抗体和(或)自身致敏淋巴细胞所引起的病理过程，不仅有抗体（IgG和/或 IgM）介导的体液免疫反应参与，也有 T细胞介导的细胞免疫反应参与。抗原抗体形成免疫复合物可以吸引中性粒细胞等炎性细胞聚集并产生炎性介质，造成自身免疫反应性炎症。炎性介质可增加血管通透性，促进巨噬细胞吞噬抗原抗体复合物，在吞噬过程中释放溶酶体性蛋白酶，其分解蛋白聚糖，降解胶原分子，造成组织损伤，从而引起腰腿痛17。Geha等18研究认为当退变或外伤导致椎间盘抗原成分进入血循环后，即可通过抗原、T淋巴细胞、B淋巴细胞间相互作用，产生自身免疫应答反应，表现在细胞免疫和体液
22、免疫反应的异常。3.1.1腰椎间盘突出症患者机体细胞免疫反应Th1和 Th2细胞是 Th细胞 (CD4+细胞)中两个主要的效应细胞亚群，分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答。根据细胞因子分泌模式，CD4+细胞可分为 Th1和 Th2亚群，Th1主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-、TNF-和 TNF-称为 Th1型细胞因子，介导细胞免疫、细胞毒性 T细胞(CTL) 和巨噬细胞活化以及迟发型超敏反应；其作用是诱导过度自身免疫反应，促进自身免疫病的发生。Th2主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13，称为 Th2型细胞因子，介导体液免疫、B细胞和嗜酸性粒细胞活化以及 I
23、gE的生成；其作用是诱导免疫耐受，阻止自身免疫疾病的发生。由 Th1/Th2亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用19 。在疾病的状态下，Th细胞受特异性抗原的刺激时，在不同因素的作用下， Th选择性向 Thl或 Th2细胞分化，这些因素包括在抗原呈递水平的细胞因子微环境、细胞膜表面分子、抗原的种类和剂量、抗原呈递细胞及其它一些水平的调控因子等。其中IL-12、IL-4 对 Th1/Th2细胞分化起关键性作用20。IL-12 是 Thl分化的必需因子；IL-4是 Th2分化的必需因子。IL-12 主要由活化的单核吞噬细胞受抗原刺激时产生有很强的促进 Thl细胞分化作用，并抑制
24、IL-4表达。细胞因子参与自身免疫过程的机制，尤其是在 T细胞介导的自身免疫性疾病中起10对腰突症患者自身免疫状态进行了系统研究认为髓核重要的作用。研究表明21-24IL-12是一种诱导 Th1型免疫反应的细胞因子，在 T细胞介导的自身免疫病中起重要作用。IL-12与自身免疫病的遗传易感性有关。一是因为自身反应性 T细胞本身可诱导抗原递呈细胞产生 IL-12；二是在有发生自身免疫病倾向的小鼠中，IL-12受体的 亚单位在自身抗原诱导表达到一定水平时，可促使自身反应性 T细胞向 Th1分化，从而产生破坏性的炎症反应。在自身免疫性肺炎中，如个体发生感染时，抗原递呈细胞迅速产生 IL-12，传递产生
25、炎症免疫反应的信号，从而进一步诱发自身反应性 T细胞的激活和 Th1型分化，加重自身免疫性肺炎的病情。研究表明 IL-6能促进 B细胞、细胞毒性 T淋巴细胞的分化和免疫球蛋白的分泌。研究表明 IL-10一种重要的免疫调节因子，有强大的抑制巨噬细胞活性的作用，对 IL-6、TNF-等促炎因子有抑制作用；TNF-主要由活化的单核/ 巨噬细胞分泌，促进细胞和体液免疫反应。多项研究21-24证实正常椎间盘中不含或有含量很低的细胞因子，而在椎间盘退变，尤其髓核脱出时，椎间盘内 IL-12、IL-6 、TNF-等细胞因子含量明显增高，并引起脑脊液、外周血内 IL-l2、IL-6 、TNF-等细胞因子含量增
26、高，刺激神经根和脊神经，导致下腰痛和神经根性放射痛。本实验研究结果显示腰椎间盘突出症患者术前血清 IL-6、IL-10、IL-12 、TNF-平较正常人均升高，与上述研究结果相一致。Gertzbein等25-27通过大量动物实验和临床研究，提出椎间盘是一种自身免疫病。近年研究发现辅助性 T(Th)细胞及其细胞因子在自身免疫性疾病的发病及治疗过程中有非常重要的作用28，尤其是在一些自身抗原尚不清楚的自身免疫疾病采用绕过抗原监测调节细胞因子的平衡是观察疾病发展和控制自免疾病的有效手段。目前已经发现在很多自身免疫疾病中存在 Th1/Th2型细胞因子表达不平衡的情况，如类风湿性关节炎、莱姆病、多发性硬
27、化症、胰岛素依赖型糖尿病、和慢性甲状腺炎中 Thl及其细胞因子占优势这些疾病可归为 Thl状态；而在过敏性疾病、哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮以及 HIV感染中 Th2及其细胞因子占优势，处于 Th2状态29。根据 Naylor提出的自身免疫说学理论，在突出的椎间盘组织中以 Th1优势状态为主。Park 等30 人对 40例腰突症患者进行研究，采用 ELISA法检测突出椎间盘组织中 Th1型细胞因子 INF-、IL-12和 Th2型细胞因子 IL-4的表达，发现在破裂组中INF-、 IL-12的表达明显高于未破裂组；而后者突出椎间盘组织中 IL-4的含量高于破裂组患者。作者认为正是由于 Th2型
28、细胞因子 IL-4的表达使得未破裂组椎间盘组织处于免疫豁免状态，而纤维环破裂后，髓核暴露给硬膜外腔的免疫系统，INF-、IL-12高度表达，Th1/Th2产生漂移，处于 Th1优势应答状态，引起过度自身免疫性炎症的发生，对神经根造成病理损害。国内王葵光、胡有谷等1111突出后可导致 T淋巴细胞亚群的变化，主要表现为细胞毒作用和迟发型超敏反应，表明腰突症患者处于 Th1细胞因子优势应答。魏延辉、马信龙15在 IL-12、Th1和 Th2型细胞因子在椎间盘突出组织中的表达及意义中指出破裂型腰椎间盘突出是在退变的基础上伴有损伤，机体修复反应使得隐蔽抗原暴露于循环系统，巨噬细胞浸润促进了 IL-12分
29、泌，改变了 Th1/Th2型细胞因子表达方式，为 Th1细胞因子优势应答，产生大量促炎因子，引起神经根炎症和水肿，导致腰腿痛和坐骨神经痛。本实验研究结果显示腰椎间盘突出症患者术前 Th1型细胞因子 TNF-较对照组明显升高，腰椎间盘突出症患者术前 IL-12较对照组明显升高，促进 Thl细胞分化，验证了腰突症患者处于 Th1细胞因子优势应答。3.1.2腰椎间盘突出症患者机体体液免疫反应目前，研究多证实 LDH患者或动物模型的髓核/血清中有 IgG、IgM 存在。pennington等31 首次发现狗正常髓核组织中存在完整的免疫球蛋白 IgG分子，一旦髓核突出或漏逸出纤维环可能激活补体级联反应引
30、起炎症反应。spliopoulou等12 研究发现 LDH患者血清和脑脊液 IgG和 IgM均较正常人增高。国内张强13 用比浊法对腰椎间盘突出患者的血清和脑脊液进行了免疫球蛋白定量分析，发现患者的血清和脑脊液中 IgG和 IgM明显升高。王葵光，胡有谷11发现 LDH患者血清中免疫球蛋白的升高，椎间盘组织的自身抗体主要是 IgG和 IgM。本研究结果显示腰椎间盘突出症患者血浆球蛋白 IgG、IgM较正常人明显升高，与上述文献报道一致，印证腰椎间盘患者存在自身体液免疫状态的异常。血清中免疫球蛋白的升高可能机理国内学者32认为，椎间盘组织中的、型胶原，糖蛋白和软骨终板基质是潜在的自身抗原，它可激
31、发机体由迟发超敏反应性 T淋巴细胞和细胞毒性 T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，导致椎间盘的早期退变，在 T、B淋巴细胞和椎间盘抗原的不断作用下，进而产生体液免疫反应，表现为血清中免疫球蛋白的升高。3.2医用臭氧介入治疗对腰椎间盘患者机体自身免疫反应影响3.2.1臭氧对机体免疫系统的影响实验表明臭氧对机体免疫系统中 T淋巴细胞和 B淋巴细胞及抗体均有不同程度的影响。(1)臭氧对 T淋巴细胞的影响： Peterson等33研究表明，人体暴露于 0.4ppm臭氧 4个小时，外周血 T淋巴细胞对植物血凝素（ PHA）的反应即受到抑制。Mirdza的实验也报告了同样的研究结果。他们认为臭氧及其中间产物很可
32、能是通过氧化淋巴细胞表面的疏基而影响淋巴细胞的代谢过程。推测暴露于臭氧下可以引起机体 T淋巴细胞免疫功能受损，由此可能造成机体处于免疫抑制状态，从而引发一些恶性肿瘤和机会性感染的发生。(2)臭氧对 B淋巴细胞的影响：小鼠暴露于 0.8ppm臭氧两周，即12。研究结果不难发现，臭氧对机体的影响主要表现在对免疫系统功能的抑制作用可抑制其对绵羊红细胞的原发性抗体反应，若连续暴露于 0.59ppm臭氧，发现小鼠有较高的破伤风发病率与死亡率，说明臭氧降低了机体对破伤风毒素的体液免疫功能34-35上，这种作用主要是通过对细胞免疫(T淋巴细胞)和体液免疫 (B淋巴细胞)的抑制效应而体现的。3.2.2臭氧对淋
33、巴细胞的影响Bocci等 36研究认为，臭氧在一定浓度下具有免疫激活和调节的作用。臭氧作用全血，可诱导产生众多细胞因子，包括干扰素（IFN-、）、白细胞介素（IL-l、2、4、6、8、10）、肿瘤坏死因子（TNF-）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和生长因子（TGF-l ）。现已知 IL-2和 TNF-具有调节免疫作用，激活细胞毒性 T细胞（CTL）、NK细胞及抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）；IL-10和 TGF-1具有超强免疫抑制作用，能抑制巨噬细胞的活化，抗原提呈细胞功能。臭氧对免疫细胞作用机理还未明确。可能是作用细胞膜上不饱和脂肪酸反应生成脂质过氧化氢链，脂质过氧化氢链进人
34、细胞浆，可激活核因子 NFkB，激活细胞基因复制转录和翻译，促进蛋白质合成，细胞因子释放。3.2.3医用臭氧治疗对腰椎间盘突出症患者机体自身免疫反应的影响3.2.3.1医用臭氧介入治疗对腰椎间盘突出症患者体液免疫的影响本研究结果显示腰椎间盘突出症患者术后三天、一月血清免疫球蛋白 IgG、IgM水平较术前明显降低（p0.01），提示医用臭氧可能对腰椎间盘突出所引起的自身免疫反应有一定的抑制作用。本研究结果显示实验组术后三天、一月血清 Th2型细胞因子 IL-10水平较术前升高。早期推测可能是与臭氧对淋巴细胞作用有关，诱导机体产生免疫抑制性细胞因子 IL-10和 TGF-，阻止自身免疫疾病的发展和
35、诱导免疫耐受，间接抑制自身免疫反应的发生和发展，达到抑制机体的自身免疫反应。本研究结果显示腰椎间盘突出症患者术后一月血清免疫球蛋白 IgG、IgM水平较术后三天降低（p0.05 ）。晚期推测可能与医用臭氧强的氧化作用有关，能氧化髓核组织中的蛋白多糖，并能破环髓核细胞，从源头上切断了自身抗原的表达，从而在一定程度上抑制了自身免疫的发生。3.2.3.2医用臭氧介入治疗对腰椎间盘突出症患者细胞免疫的影响本研究结果显示实验组术后三天、一月血清 Th2型细胞因子 IL-6、IL-10水平较术前均升高（p0.05 ）。促 Th1分化因子 IL-12术后三天、一月血清水平较术前降低（p0.05）。说明医用臭
36、氧能增加 Th2型细胞因子的分泌，纠正 Th1/Th2失衡，提示医用臭氧可能对腰椎间盘突出所引起的细胞免疫反应有一定的抑制作用，推测可能与臭氧对淋巴细胞作用有关，刺激机体产生 IL-4，减少 IL-12的表达，增加 Th2型细胞13因子的分泌，表现为 IL-6、IL-10 含量的升高。但医用臭氧引起细胞因子 IL-6、IL-10、IL-12变化的具体机制以及医用臭氧引起 IL-4等其它细胞因子的变化有待进一步研究。144.结论1.腰椎间盘突出症患者存在自身免疫状态的异常改变，表现在细胞免疫和体液免疫两个方面。2.医用臭氧在腰椎间盘突出症的介入治疗中发挥了免疫抑制作用。3.抑制自身免疫反应是医用
37、臭氧介入治疗腰椎间盘突出症重要机制之一。4.免疫疗法有望成为今后腰椎间盘突出症治疗方法之一。15参考文献1谭冠先疼痛诊疗学M第 1版北京：人民卫生出版社，2000，1082Bocci VBiological and clinical effects of ozoneHas ozone therapy a future inmedicine J Br J Biomedical Sci，1999，56（4）：270-2793Bocci VAutohaemotherapy after treatment of blood with Ozone：a reappraisalJIntMed Res，199
38、4，22(3) ：l3l-l44 4Bocci V，Luzzi E，Corradeschi F，et a1 Studies on the biological effects of ozone ：Ill，an attempt to define conditions for optimal induction of cytokines LymphokineJCytokine Res，1993，12(2)：121-126 5俞志坚，何晓峰，陈勇，等经皮腰椎间盘内臭氧注射的动物实验研究J中华放射学杂志，2002，36(4)：366-3696俞志坚，何晓峰，陈勇，等低浓度医用臭氧与医用纯氧对犬髓核组
39、织形态的影响J 广东医学，2004，9（25）：1019-10207Muto M， Avella FPercutaneous treatment of herniated lumbar disc by intradiscaloxygen-ozone Therapy for Lumbar Disk HreniationJInterventional Neuro radiology，1998，4(2)： 273-2868Bonetti M，Fontana A，Cotticelli B，et alIntra for a mina-O2-O3 versus periradicularsteroidal
40、 infiltrations in lower back pain：randomized controlled studyJAJNR ，2005，26(6)：996-10009吴清华，姜建威，吴震海，等应用臭氧椎间盘注射治疗腰椎间盘突出症162例临床探讨J南京医科大学学报，2008，4（28）：550-55310何晓峰，李彦豪，陈汉威，等臭氧治疗腰椎间盘突出症600例临床疗效分析J中国介入影像与治疗学，2005，2（5）：338-34111王葵光，胡有谷腰椎间盘突出症的自身免疫状态J中华骨科杂志，1994，14（5）：258-26212Spiliopoulou L， Korovessis p，
41、Konstantinou D，et a1IgG and IgM concentrationin the prolapsed human intervertebral disc and sciatica etiologyJSpine ，1994，19：132013张强，吴越腰椎间盘突出症脑脊液和血清免疫球蛋白升高机理的初步探讨J颈腰痛杂志，1996，17（4）：210-21214.王军强，杜冬，祝峰等腰椎间盘突出症手术前后 T淋巴细胞亚群的改变及临床意义J白求恩医科大学学报，1999，6：733-73415魏延辉、马信龙等IL-12、Th1 和 Th2型细胞因子在椎间盘突出组织中的表达16及意义
42、D中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)，2006，(09)16Marshall LL ，Trethewie TR，Cartain CCChemical radicalitisClin Orthop，1977，129：14717Fujita K，Nakagawa T，Hirabayashi K， et alNeu-tral portemases in humanintertervertebral disc：role in degeneration and probable originJ spine，1993，18：177618Geha RCellular abnormalities in
43、patients with elevated serum IgE levelsJAleeryClin Immunol，1986，78：99519Grakoui A，Donemeyer DL， Kanagawa O，etal TCR-independent pathways mediatethe effects of antigen dose and altered peptide ligands on Th cell polarizationJ Immunol1999，162 (4)：1923-1930 18王捷，陈正形腰椎间盘突出症免疫学反应的临床研究J中国中医骨伤科杂志，2004，12(1
44、)： 29-3219Jordan MS， Riley MP， von Boehmer H， Caton AJ Anergy and suppressionregulate CD4+Tcell responses to a self peptide，Eur J Immunol ，2000，30：136-14420Singer SM， Mcdevitt HOTh1 and Th2 CD4-T cells in the pathogenesis oforgan-spetic autommine diseaseJ Immunol today，1995，16：384-43821Takahasi H，Su
45、guro T，Okazima Y，et a1Inflammatory cytokines in the herniateddisc of the lumbarSpine，1996，21：218-22422李新友，王民，刘森，宋红星，韩学哲白细胞介素-6在突出的腰椎间盘中的表达及其意义J中国矫形外科杂志，2001，8(6)：581-58223董革辉，黄俊琼，蔡小军，等IL-1与 IL-6在突出腰椎间盘组织中的表达中国医师杂志，2004，6(8) ：1134-113524Ozakay AC， Cavanaugh JM， Asik l，et alDorsal root sensitivity to
46、interleukin-1beta， interleukin-6 and tumor necrosis factor in rats Eur Spine，2002，11：467-47525Gertzbein SD，Tile M，Gross A，el a1Auloimmunltv degenerative disc disease ofthe lumbar spineJOrthop Clin N Am，1975，6：6726Gertzbein SD Degenerative disc disease of the lumbar spineOrthop Clin N Am，1977，129：682
47、7Gertzbein SD，Tile JH，Devlin SRThe immolation of Lymphocytes by nucleuspulposus in patients with degenerative disc disease of the lumbar spineJClin Orthop，1977，123：14928Romagnani SThe Th1/Th2 paradigm Immunol Today，1997，18(6) ：263-26629Liblau RS，Singer SM，Mcdevitt HOTh1 and Th2 CD4-T cells in the pa
48、thogenesis17of organ-spetic autoimmune diseaseJimmunol today，1995，16：383-43830Park JB，Chang H，Kim YSThe pattern of interleukin-12 and T-helper types 1 and2 cytokine expression in herniated lumbar disc tissueJSpine ，2002，27(19) ：2125-212831Pennington JB ，McCarron RF，Laros GSIdentification of IgG in the canineintervertebral discJSpine，1998，13：90932张强，吴越腰椎间盘突出症脑脊液和血清免疫球蛋白升高机理的初步探讨J颈腰痛杂志，1996；17（4）：210-21233Peterson MLEnviron Res 1981，24（2）：299-30834Fujimaki HCell Immunol 1983，99：13504535Hassett CToxicol Lett 1985，26（2）：139-14436
