1、中国医科大学硕士学位论文在原代培养的人细胞滋养细胞中激活素A对血管内皮生长因子及其受体表达的影响姓名：戴进申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：尚涛20060401英文缩略语， 中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名： 啦 魄
2、掣中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：在原代培养的人细胞滋养细胞中激活素对血管内皮生长因子及其受体表达的影响目 的血管内皮生长因子（ ，）家族是一类多功能的细
3、胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用，可促进内皮细胞增殖、促进血管生成以及增加血管的通透性。血管内皮生长因子在女性生殖方面贯穿从受精到胎儿分娩全过程，在滋养细胞增殖与侵入及胎盘的发生发展过程中有重要作用。在妊娠早期，胎儿一胎盘的生长发育主要取决于细胞滋养细胞（，）分化和子宫胎盘血管网络的构建。存在两条截然不同的分化途径，一方面可分化形成合体滋养细胞（，），执行妊娠分泌功能；另一方面分化形成侵润型滋养细胞（ ），向母体侵润，分化并替代血管内皮细胞，降鳃血管平滑肌及弹力纤维，以至血管腔扩大，血流阻力下降，血流量增加，形成高排低阻血管，进行母胎界面的血管重铸。这种血管 “重铸 ”
4、是由细胞滋养细胞逐渐分化为类血管内皮细胞并替代螺旋小动脉血管内皮细胞而完成的。细胞滋养细胞分化和（或）替代不良导致的植入期血管 “重铸 ”障碍是妊娠失败和某些疾病的发生机制。激活素是 家族中的一员，由于在垂体前叶可刺激的的释放的功能而被分离纯化出来并被命名。近年来的有关激活素的研究表明，激活素在多种生物系统中发挥重要的作用，尤其是在细胞增殖分化、凋亡和癌变中的功能备受关注。激活素由亚基构型的不同而分为三型，即激活素、激活素和激活素。激活素在人体组织中分布广泛，其中胎盘中只有激活素表达。近年来的研究表明激活素可通过调节的表达而参与血管生成。 等报道激活素诱导体外培养的牛动脉血管内皮细胞（ ，）形
5、成血管。在此过程中有明显的及其受体的表达升高，应用激活素的拮抗剂卵泡休止素可阻抑血管生成，得出激活素可调节的表达进而诱导形成血管的结论。有关激活素是否可调节人细胞滋养细胞分泌国内外尚无人报道。本实验通过建立人细胞滋养细胞无血清培养方法，探讨激活素在人细胞滋养细胞中对分泌是否具有调节作用。若此项研究成功，一方面可以从胚胎植入发生机制人手，为 “有效 ”的妊娠提供备选分子，以期应用于试管婴儿等辅助生殖技术中；另一方面，由于某些疾病患者胎盘中存在着激活素和的异常表达，可应用此机制深入探讨疾病病因，并提供早期诊断筛查指标，如妊娠期高血压疾病等。方 法本研究以正常妊娠周的绒毛组织为材料，用无血清培养方法
6、体外培养人细胞滋养细胞。免疫细胞化学确认人细胞滋养细胞中及其相应受体一，一的表达。 检测激活素作用前后人细胞滋养细胞的， 一及一的表达。结 果无血清培养细胞滋养细胞有及其受体一和一的表达。表达部位主要集中在细胞膜，其次在细胞质中；而 表达部位主要集中在细胞膜上；二表达于细胞质中。 结果显示激活素可显著上调，一和一的水平表达，并存在剂量依赖关系。结 论无血清培养的细胞滋养细胞有及其受体一和一的表达。激活素刺激可显著上调，一和一的水平表达，为进一步研究激活素对在蛋白质水平上调节打下了实验基础。从胚胎植入发生机制人手，为 “有效 ”的妊娠提供备选分子而应用于辅助生殖研究中，提高成功率。同时为探讨某些
7、疾病病因或寻找某些疾病早期诊断筛查指标，如妊娠期高血压疾病等提供理论和实践基础，补充了激活素在妊娠期高血压疾病中的作用。关键词血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；细胞滋养层细胞激活素；血管重铸 ， ， ， ， （扭 ，） ， 虹 （） ； （ ） ， ， ， ， ， （） ， ， ， ， ， ， ， （ ，） ， ， ， ， ， ， ” ” ， 【 ， ， 仃 一 ，一， 一 一 ， ； 一 ； 一 ” ” 玎 ； ； ； 在原代培养的人细胞滋养细胞中激活素对血管内皮生长因子及其受体表达的影响刖 罱血管内皮生长因子（ ，）家族是一类多功能的细胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的
8、调控作用，可促进内皮细胞增殖、促进血管生成以及增加血管的通透性。血管内皮生长因子在女性生殖方面贯穿从受精到胎儿分娩全过程，在滋养细胞增殖与侵入及胎盘的发生发展过程中有重要作用 。在妊娠早期胎儿一胎盘的生长发育主要取决于细胞滋养细胞（，）分化及其参与的子宫胎盘血管网络的构建。存在两条截然不同的分化途径，一方面可分化形成合体滋养细胞（），执行妊娠分泌功能；另一方面分化形成侵润型滋养细胞（ ），向母体侵润，分化并替代血管内皮细胞，降解血管平滑肌及弹力纤维，以至血管腔扩大，血流阻力下降，血流量增加，形成高排低阻血管，进行母胎界面的血管重铸。这种血管 “重铸 ”是由细胞滋养细胞逐渐分化为类血管内皮细胞并
9、替代螺旋小动脉血管内皮细胞而完成的。细胞滋养细胞分化和（或）替代不良导致的植入期血管 “重铸 ”障碍是妊娠失败和某些疾病的发生机制 一。激活素（ ）是转化生长因子家族（ ， ）中的一员，已有的研究表明激活素在细胞增殖、凋亡以及癌变过程中都有重要的调节作用。近年来，胎盘中激活素的表达及其功能得到了广泛的研究。已证实胎盘滋养层细胞中存在激活素。和等人用免疫组化和原位杂交证明妊娠早期的细胞滋养层细胞中有激活素的合成，它的合成受，和等的调节，在足月胎盘中的研究表明它们能局部地调节，和孕酮的合成，而且等人认为它们对的调节可能是通过起作用 “。这些结果表明，激活素可能通过自分泌机制调节滋养层细胞的功能。
10、近年来的研究表明激活素可通过调节的表达而参与血管生成。 等报道在感染的角膜细胞中激活素可通过和通路上调的表达，并可促进感染的角膜新生血管。 哺等报道在体外培养的肝窦内皮细胞激活素可调节受体的表达上调，通过放大的作用活性，激活素可促进肝窦内皮细胞生长和分化形成新生血管。 【 等报道激活素诱导体外培养的牛动脉血管内皮细胞（ ，）形成血管，在此过程中有明显的及其受体的表达升高，应用激活素的拮抗剂卵泡休止素可阻抑血管生成，得出激活素可调节的表达进而诱导形成血管的结论。人细胞滋养细胞既表达激活素又表达，激活素是否调节人细胞滋养细胞分泌国内外尚无人报道，需要进一步深入探讨。此项研究如成功，一方面可以从胚胎
11、植入发生机制人手，为 “有效 ”的妊娠提供备选分子，可应用于试管婴儿等辅助生殖技术；另一方面，由于某些疾病患者胎盘中存在着激活素和的高表达，可应用此机制深入探讨疾病病因，并提供早期诊断筛查指标，如妊娠期高血压疾病。因此有关人细胞滋养细胞中激活素对的作用研究具有理论研究和临床应用意义。材料与方法一、研究对象年月至年月期间于中国医科大学附属二院计划生育手术室获取正常妊娠 周的绒毛。选中患者排除高血压、心脏病、肾病、既往妊娠期高血压疾病等妊娠各种合并症和并发症病史，无肝炎、结核、性病等传染病病史。二、实验方法细胞滋养层细胞的分离和无血清培养细胞滋养层细胞的分离和无血清培养参考李荣皓等建立的方法口。细
12、胞培养准备、培养液配制： 培养液 （）万（无一， ”）（）配制好的、经安装有，滤纸的灭菌滤器过滤除菌。、培养瓶铺胶：冰浴型胶原【 （：稀释）。冰浴新鲜倍比稀释，室温过夜上吸去上清，风干、紫外照射，。保存备用、无菌处理：培养所用塑料、玻璃制品。高压除菌，金属制品酒精浸泡除菌。培养间、操净台用前紫外照射。细胞滋养层细胞原代无血清培养无菌滋养层组织（绒毛）浸于冰浴培养液 漂洗 次以去除血块将绒毛剪成 的小块组织。消化约终止消化， 孵育 目和目双层尼龙网过滤，离心收集细胞的密度梯度沉降，收集下层的滋养细胞用含有、和的无血清培养液悬浮细胞接种于涂有 的培养皿，、温箱中培养接种后细胞贴壁，换入新鲜培养液、
13、细胞免疫化学培养后的细胞滋养层细胞用细胞免疫化学行，一和表达检测，方法如下：培养的细胞用戊二醛固定分钟。（清洗次封闭分钟力 人抗、一、一。孵育小时。清洗次加入二抗。孵育小时 显色自来水冲洗，苏木精复染 上行酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片、 总的提取和纯化总按试剂说明提取，具体操作如下：把应用不同剂量激活素刺激培养的细胞滋养细胞在培养的后提取细胞块分别用电动匀浆器在试剂中破碎。（ 组织 ，冰上，-91，转头直径 ）匀浆液移至离心管，室温放置 加入斗氯仿，用力振荡 ，室温放置 、，离心 使液体分层将上层含的水相吸至新离心管中，加入 异丙醇，轻轻晃匀，室温放置 使沉淀；。、，离心 ，使在离心管底积压
14、成小块倾去异丙醇，以乙醇洗涤沉淀，。、， 离心 收集室温干燥至半透明状，并以适量水溶解 ， 酚氯异丙醇（：）抽提，酒精沉淀，溶于适量水取少量样品：稀释后，用紫外分光光度计测定浓度，并以比值评估的纯度（应在 ）。以 的琼脂糖凝胶电泳检测质量，： 在紫外下的亮度达到 ，且 带很弱者可视为高质量的总。总样品加入酶抑制剂后于一 冰箱保存。 的合成一逆转录以体系说明的合成流程，具体叙述如下： 总水混匀，离心 。，冰上加入缓冲液（ ）摇匀， 加入 反转录酶摇匀 分装成几个小管，一。储存备用半定量溶液配制（ ， ） 缓冲液 “ 去离子水（ ）缓冲液 瞄 冰乙酸 去离子水至在数据库中检索后设计特异引物，具体如
15、表。 表引物序列各引物扩增条件如表。表各引物扩增条件流程：去离子水 （ ） 一反应体系模板上游引物下游引物 斗训 ， 一 ，；一 ，（重复次）产物电泳和半定量分析取反应产物，加上样缓冲液，于琼脂糖凝胶电泳（，），紫外下凝胶成像。亮度扫描的结果经 亮度值校正。四、统计方法半定量 的亮度扫描的结果经母一亮度值校正后，将三次实验的结果进行统计，表示为曼 ；采用配对检验（ ）方法进行显著性分析，为显著差异。结 果一、无血清培养细胞滋养细胞，一和表达无血清培养细胞滋养细胞有及其受体一和的表达，表达部位主要集中在细胞膜，其次在细胞质中；而一表达部位主要集中在细胞膜上；表达于细胞质中。如图。图：表达；：一表
16、达；：表达；：阴性对照。放大倍数二、激活素对，一和表达调节 结果显示激活素可显著上调，一和一水平表达，并存在剂量依赖关系。如图，。一如畸厶一 一九朋 ，呻毒好。厶从 矿 ， ，口图不同剂量激活素对细胞滋养细胞表达调节。：；：阴性对照；：激活素刺激；：激活素刺激；：激活素刺激纠呻呐刁砷， 。）从 口 沾 如 妙图不同剂量激活素对细胞滋养细胞一表达调节。：；：阴性对照；：激活素刺激；：激活素刺激；：激活素刺激 却而斌一一垂 一呻图不同剂量激活素对细胞滋养细胞一表达调节。：；：阴性对照；：激活素刺激；：激活素刺激；：激活素刺激讨 论胚胎植入是妊娠建立过程中关键且复杂的步骤，受多种因素影响。正常植入过
17、程中母胎界面的血管要进行 “重铸 ”以适应妊娠母儿对高血流量的要求，这种血管 “重铸 ”是由细胞滋养细胞逐渐分化为类血管内皮细胞并替代螺旋小动脉血管内皮细胞而完成的。细胞滋养细胞分化和（或）替代不良导致的植入期血管 “重铸 ”障碍是妊娠失败和某些疾病的发生机制口。本实验以妊娠 周的绒毛为材料，通过细胞滋养细胞分离和无血清培养及细胞免疫化学检测，一和一在体外培养的人细胞滋养细胞中的表达， 验证激活素作用前后人细胞滋养细胞中，一及一的表达。我们的研究结果表明，及其受体一和一在体外无血清培养的原代人细胞滋养细胞中都有表达，表达部位主要集中在细胞膜，其次细胞质中；而一表达部位主要集中在细胞膜上；一表达
18、于细胞质中。 结果显示激活素刺激可显著上调， 和一的水平表达（），并存在剂量依赖关系。 】 在我们的实验中主要创新点集中于：我们在借鉴中科院动物研究所无血清细胞滋养细胞培养方法的基础上不断实验摸索，在中国医科大学首次建立了细胞滋养细胞无血清培养方法。由于细胞滋养细胞在有血清的条件下很快会合体化，转化成合体滋养细胞而失去增殖浸润的能力，所以必须使用无血清方法来培养。这种培养方法要求的条件比较苛刻，在我们有限的实验条件下建立此种细胞培养方法比较困难，我们在多次试验后终于建立细胞滋养细胞无血清培养平台。我们建立了人早孕细胞滋养细胞及其受体表达模型。由于在原代细胞培养的过程中，某些蛋白的表达会因培养方
19、法的不当而丢失，因此我们通过细胞免疫化学的方法验证了人早孕细胞滋养细胞及其受体表达，结果证实在我们培养方法中细胞滋养细胞没有丢失及其受体表达。用 检测激活素作用前后人细胞滋养细胞的，肿一，一的表达，结果显示激活素可显著上调，一和一水平表达，并存在剂量依赖关系。为进一步研究激活素对在蛋白质水平上的调节打下了实验基础。我们在人细胞滋养细胞中激活素对调节的研究在国内外尚属首次。及其受体是正常妊娠建立和维持的必需因子。在妊娠早期的表达异常，可能造成胚胎植入障碍而导致流产的发生 “。而在妊娠期高血压疾病患者胎盘中始终处于平缓高表达引，高表达的可能是妊娠期高血压疾病血管发生和内皮细胞功能障碍的反馈结果 “
20、。 有关及其受体在正常和某些病理妊娠中表达变化国内外都有报道。 等报道在正常妊娠胎盘中水平和蛋白水平表达情况，并检测了妊娠期高血压疾病患者胎盘中相应表达，结果发现在正常妊娠中始终处于平缓高表达，是正常妊娠建立和维持的必需因子。而妊娠期高血压疾病表达则显著增高，高表达的是妊娠期高血压疾病血管发生和内皮细胞功能障碍的反馈结果。 【 刮等报道报道了早期妊娠表达情况，由于胚胎血管发生一般从妊娠天开始，因此 等检 测了妊娠 周的绒毛，结果显示高表达的参与了妊娠早期的血管建立。国内的 等报道了及其受体在恒河猴母胎界面的表达，为在血管 “重铸 ”中起到重要作用的理论提供佐证。近年来的研究表明激活素可通过调节
21、的表达而参与血管生 成。 等报道在感染的角膜细胞中激活素可通过和通路上调的表达，并可促进感染的角膜新生血管。 扣 等报道在体外培养的肝窦内皮细胞激活素可调节受体的表达上调，通过发大的作用活性，激活素可促进肝窦内皮细胞生长和分化形成新生血管。 【 等报道激活素诱导体外培养的牛动脉血管内皮细胞（ ，）形成血管，在此过程中有嘎显的及其受体的表达升高，应用激活素的拮抗剂卵泡休止素可阻抑血管生成得出激活素可调节的表达进丽诱导形成血管的结论。我们在人细胞滋养细胞中激活素对调节的研究在国内外尚属首次。我们的研究结果将为探讨某些疾病病因或寻找某些疾病早期诊断筛查指标，如妊娠期高血压疾病等提供理论和实践基础。由
22、于是胚胎植入时期的重要分子，因此从胚胎植入发生机制人手，为 “有效 ”的妊娠提供备选分子而应用于辅助生殖研究中，提高成功率。为进一步研究激活素对在蛋白质水平上的调节打下了实验基础，补充了激活素在妊娠期高血压疾病中的作用，为深入探讨胚胎植入机制，妊娠期高血压疾病发生机制等奠定实验基础。结 论无血清培养的原代人早孕细胞滋养细胞有及其受体一和一的表达。激活素可显著上调细胞滋养细胞中，一和一盼水平表达。为进一步研究激活素对的在蛋白质水平上调节打下了实验基础；还可以从胚胎植入发生机制入手，为 “有效 ”的妊娠提供备选分子而应用于辅助生殖研究中，提高该技术的成功率；为探讨某些疾病病因或寻找某些疾病早期诊断筛查指标，如妊娠期高血压疾病等提供理论和实践基础；补充了激活素在妊娠期高血压疾病中的作用。
