1、华南师范大学实验报告学生姓名 吴志军 学 号 20082502046 专 业 生物工程 年级、班级 08 工程 1 班 课程名称 下游技术 实验项目 酵母 RNA 提取 实验类型 验证 设计 综合 实验时间 2011 年 10 月 17 日实验指导老师 江学文 实验评分 实验三 酵母 RNA 的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取 RNA 的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理由于 RNA 的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常
2、用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA 即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA 和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA 即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去 DNA 和蛋白质。上述方法提取的 RNA 具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取 RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用 10%左右氯化钠溶液，90提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀 RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调 pH2.5 利用等电点沉淀。 酵母含 RNA 达 2
3、.67-10.0%，而 DNA 含量仅为 0.03-0.516%，为此，提取RNA 多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C 一C=C-） ，能够强烈吸收 250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在 260nm 处。遵照 Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同 pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的 pH 溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数） ，通常以
4、（）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在 260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收） 。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的 pH 和离子强度发生变化。RNA 溶液（pH = 7.0）的 （）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为 9.5%，含 1g /mL RNA 溶液的光密度为 0.022-0.024。因此，测定未知浓度的 DNA（RNA）溶液的光密度 OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸 3g/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族
5、氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处，在 260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、主要仪器和试剂啤酒酵母粉0.04M NaOH 溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加 0.3mL HCl。紫外分光光度计离心机真空干燥箱三角瓶、烧杯水浴锅四、实验步骤1、称 5g 干酵母粉悬浮于 30mL 0.04M NaOH 溶液中，并在研钵中研磨均匀。2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热 30min，冷却，转入离心管， 3000 转/分，离心 15 分钟后，将上清慢慢倾入 10mL 酸性乙醇，
6、边加边搅动。3、加毕，静置，待 RNA 沉淀完全后，3000r/min 离心 3min。弃去上清液。用 95乙醇洗涤沉淀两次。4、再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得 RNA 粗品的重量，5、纯度测定：将样品配制成含 550g 核酸/mL 的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm 和 280nm 吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。五、计算：260./4ODRNAL浓 度 （ 微 克 克 ） 稀 释 倍 数O.D260 为 260nm 波长处的光密度读数；L 为比色杯的厚度，一般为 1 或 0.5；0.024 为1gRNA/mL 的光密度；0.02
7、0 为 1gDNA/mL 的光密度。六、实验结果与分析各小组测得的实验数据如下表：组别 稀释倍数 吸光值（OD260）1 16667 倍 0.5232 12500 倍 0.5933 14000 倍 0.4744 12500 倍 0.5745 12500 倍 0.605其中本小组为第 5 小组，稀释倍数为 12500 倍，测得的吸光值（OD260 ）为 0.605。将酵母粉处理后得到的沉淀的重量为：0.46g。滤纸 滤纸+沉淀 沉淀重量（g） 0.3040 0.7604 0.4564其中 RNA 粗品占沉淀的 70%，杂质占沉淀的 30%，故 RNA 粗品的重量为：0.460.7=0.322g。
8、纯度测定结果为：RNA 浓度（ug/g）= =稀 释 倍 数LOD024.6 gu/31504204.65RNA 纯品的质量（ug）=RNA 浓度RNA 粗品的重量=.1g13.9u.3g31504u/故甘酵母粉中 RNA 含量（%）= = =2.02%0）干 酵 母 粉 重 （ ）重 （RNA105.g分析：实验的结果测出 RNA 的含量为 2.02%，其 RNA 的含量偏低。造成这种结果的原因主要是由于对物料进行转移的时候损失的，同时测量光度值的时候造成的误差也是造成RNA 含量少的原因。七、思考题1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?答：由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而 RNA 存
9、在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出 RNA。加入 NaOH 之后水浴煮沸 30min 的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA 则从细胞中分离出来。另外细胞中含有多种分解 RNA 的酶类（如 RNase 等） ，为了避免 RNA 在提取过程中被降解，得到较为完整的 RNA 分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解 RNA 的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护 RNA 分子的作用。2.为什么用酵母作为实验原料？如何使 RNA 从酵母中释放出来？RNA 的等电点是多少？答：酵母繁殖快，
10、生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是 RNA，而 DNA 很少；RNA 提取液与菌体分离比较容易，因此酵母是提取 RNA 的好材料。工业上将 RNA 从细胞中释放出来主要有三种方法，包括稀碱法、浓盐法和自溶法。 （1）稀碱法是在一定的碱浓度下，使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而破坏细胞壁，使 RNA 从细胞中释放出来，该方法属于化学破壁法。 （2）浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压，是细胞自身破裂而释放出 RNA，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在 90100C 条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成 RNA 和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。同时，90100C 的
11、高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA 的降解。该方法属于物理化学破壁法。 （3）自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后，细胞中的溶酶体膜破裂，使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中，利用菌体自身的酶系将细胞溶解，从而释放出 RNA。通常自溶法的菌浓度为 2%，PH 值 9.510，自溶温度以6065C 为宜。RNA 的等电点为 PH2.5。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调 pH 至2.02.5，RNA 则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA 粗产品。3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构外层为甘露聚糖
12、，内层为葡聚糖，中间层为一层蛋白质分子（包括多种酶类） ，此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用，脂类发生皂化反应从而被分解，使细胞穿孔。同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解，蛋白质（包括多种酶类）也会发生变性，从而增加酵母细胞的通透性，酵母细胞原生质膜失去选择透过性，细胞就破裂使RNA 流出。4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?答：核酸是具有极性的高分子物质，根据相似相溶原理，DNA 和 RNA 都是微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于 2-甲氧乙醇，也可溶于 10%左右的氯化钠溶液，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，尤其是在 50%左右的乙醇溶液中溶解度很小。因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达 50%时，DNA 就沉淀出来，当乙醇浓度达 75%时 RNA 也沉淀出来。
