1、眼睛的分辨角我们的眼睛要能很好的分辨细节，就必须使细节对眼睛的视角比眼睛的极限分辨角大。在照明充足的条件下，人眼的极限分辨角一般为 1。如果照明条件不好，或者眼睛能舒适的观察的情况下，则一般物体对人眼睛的分辨角为 2一 4物体对眼睛视角与物体到眼睛的距离有以下关系，如图:2.1图 2.1 中物体大小一定时，当物体距离眼睛越近，物体对眼睛的视角越大。AB 与A尸高度一样，物体 AB 距离人眼较远，对人眼张角为只，才 B物体距离人眼睛比较近，对人眼张角为久，很明显，典拭，物体距离人眼越近，物体对眼睛的张角越大，但是物体距离人眼也不能无限近，必须位于眼睛的近点之外，才能被看清。正常人眼的近点距离一般
2、是 250Inm 左右，所以当物体位于最近距离而其对眼睛的视角还小于极限分辨角 1时，则必须借助放大镜或者显微镜使其分辨角大于极限分辨角，人眼才能看清楚物体的细微结构。视放大率由于眼睛作为接收单位，所以通过光学仪器来观察物体时，仪器的放大作用不能使用高斯理论中的光学系统本身的放大率刀来表示。此时有意义的是物体经过眼睛在是视网膜上所成像的大小。所以目视系统的放大率是:通过光学系统观察物体时，所成的像对眼睛所成张角的正切，以 tgW来表示，其与眼睛直接观察物体时，物体对眼睛所张角度的正切 tgW 之比。称做视放大率 f4 。我们这里用 r 来表示视觉放大率。即: 下面以单个放大镜为例，说明视放大率
3、的概念。如图 2.2 是物体经过放大镜的光路图:物体 AB 位于放大镜物方焦点附近，设 AB=y，其放大虚象 AB=y，对眼睛张角的正切为:从图中，我们可以得到:由高斯公式:将式(2.4)变形后代入式(2.3) 我们得到:再把式(2.5)代入式(2.2) 得到如果我们用眼睛直接观察，物体对人眼睛的张角为:根据前面对视觉放大率的定义，我们可以得到，视觉放大率为上式中，一 l+f，+ 乃是眼瞳到观察物体的距离，这里我们用 D 表示该距离，f+乃是眼瞳到放大镜的距离，我们用 S 来表示，8) 改写成如下形式:当物体在无穷远处时，正常人眼是处于放松状态，所以，当借助放大镜观察时，一般会使物体成像在无穷
4、远处，使眼睛处于最舒服。这时，矛=ao，上面的式子可以简化为:有时人眼为了能观察到更细微的结构，则调整放大镜与物体之间的距离，使物体经过放大镜成像在距离人眼睛 25OInln 处，即眼睛的明视距离，这时能最大限度的使用放大镜观察物体的细微结构。取 D=250，上式可写成:上面这个式子，我们称其为放大镜的视放大率。视放大率仅仅决定于放大镜的焦距。2.1.3 视度调节正常人的眼睛在没有调节的自然状态下，无限远物体所成的象正好位于网膜上。近视眼的人对无穷远物体的成像点则位于网膜前方，所以近视眼不能看清无穷远物体，而只能看清一定距离的物体。为了能看清远处的物体，就要求从目视光学仪器的目镜射出的光束是发
5、放光束:而对于远视眼，在自然状态下对无穷远物体成像点位于视网膜的后方，因此，为便于远视眼接受，则要求从目视光学仪器射出的光束为会聚光束。图 2.3 是近视眼和远视眼裸视无穷远是光线的会聚情况。目视光学仪器为了适应视力不同的人使用，是利用改变目镜的前后位置使仪器所成的象，位于前方、位于无穷远和位于后方的一定距离上来适应近视眼、正常眼和远视眼的需要的。目视光学仪器的目镜前后移动的过程就叫做目视光学仪器的视度凋节5由目视光学仪器目镜射出的光束对出射光瞳的会聚度，称为目视光学仪器的视度，通常用 N 表示。用非正常眼远点距离的倒数 (R 一与表示近视或远视眼的程度，称为视度。若远点距离的单位为米，则视度
6、的单位为折光度。例如远点距离尹=0.5m的近视眼，其近视的程度为一 2 光折度。(医院和眼镜店通常把 1 个折光度6作为100度。一 2 折光度就是 200 度)，图 2.4 是使用眼镜对近视和远视眼进行矫正的原理。对于近视眼必须将仪器的目镜向里调，由目视光学仪器物镜成的象必然落在目镜前焦面以内，所以由目镜射出的光束是发散光束，相当于近视眼戴上了一块负透镜的眼镜，以适合近视眼观察。对远视眼，就必须将目镜往外调，以使物镜所成的象落在目镜的前焦面以外，这样由目镜射出的光束是会聚光束，其作用与远视眼戴上正透镜的眼镜一样。可见，不同视力的人眼对物镜成像光线有不同的要求。由于这个原因，使得目镜系统必须有
7、一定的工作距离以便调节适应不同视力的人眼。目镜概论工程硕士学位论文是出射光瞳，它限制成象光束的孔径。其通过放大镜的共扼象为入射光瞳。可在物或象平面设有视场光阑。放大镜本身是渐晕光阐又是入射窗和出射窗。因为有渐晕存在，在线渐晕系数为零处，即 BZ 点，限定了可见视场。图 2.5 放大镜系统的光阑2.2 放大镜的孔径光阑和视场光阑目镜系统从原理上一说其实就是一个复杂化的放大镜，所以了解其特点可以先从最简单的单片式放大镜的原理说起。由单透镜构成的低倍放大镜，其光束限制的问题往往和眼瞳结合起来考虑。人的眼瞳作为这个光学系统的一个光孔。系统中有两个光孔:放大镜的镜框，设直径是 Za;眼睛的瞳孔，设直径是
8、 2 口。这个时候眼瞳是整个系统的出瞳，就是孔径光阑。另外，因为整个系统中只有两个光孔，所以另一个光孔，就是放大镜框，所以它本身必然起着限制视场的作用，充当了系统中视场光阑的作用。同时，也是入射窗和出射窗。由于系统的入射窗于物平面不重合，所以，该系统必定会有渐晕的现象。物平面上成像范围(线视场的大小)，与放大镜框，眼瞳直径，以及它们之间的距离所决定。如图 2.5 所示。物平面置于放大镜的前焦面附近，眼睛处于放大镜的后焦面附近，假设在眼球光轴和放大镜光轴处于共线的情况下来考虑的。此时眼瞳是孔径光阑，也是出射光瞳，它限制成象光束的孔径。其通过放大镜的共扼象为入射光瞳。可在物或象平面设有视场光阑。放
9、大镜本身是渐晕光阐又是入射窗和出射窗。因为有渐晕存在，在线渐晕系数为零处，即 BZ 点，限定了可见视场。图 2.5 放大镜系统的光阑。其中，角度为 2 记，的视场内没有渐晕，在这个范围内每点均以充满眼瞳的全光束成像7 ，由 2w所决定的 50%的则是有渐晕的视场。 ，而由 2w2 所决定的则是放大镜所可能成像的最大视场。由上图我们可以得出，三种情况的视场与镜头参数的关系如下:公式中可以看出，放大镜镜框的直径与视场成正比，眼睛与放大镜距离与视场成正比。我们用物平面上的圆的直径或者线视场 2Y8来表示视场的大小。当物平面位于放大镜的物方焦点上时，此时，像平面必定在无限远处.如下图 2.7 所示:公
10、式中可以看出，放大镜的视放大率与视场成反比。显微镜的光学原理2.1 折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。2.2 凸透镜的五种成象规律(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小 倒立实象；(2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；(3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放的倒立实象；(4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；(5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，
11、则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。2.3 显微镜的成像原理普通光学显微镜的构造主要分为 3 部分: 机械部分、照明部分和光学部分, 显微镜的光学部分是由物镜和目镜两个凸透镜组成的. 如图 1 所示,当待测物体 A B 放在物镜 Lo 焦点外侧时, 在物镜 Lo 后所成的实像 A1 B1 恰在目镜 Le 焦点内侧靠近焦点处, 经目镜再次放大成一虚像 A2 B2 . 这样观察者看到的是经两次放大后的倒立的虚像, 这就是显微镜放大成像的基本过程.图 1 普通光学显微镜成像原理图对于一个成品显微镜来说, 我们需要应用一些光学技术参数来描述它的工作性能, 其中一个重
12、要的参数就是显微镜的放大率 M, 它可以描述显微镜的放大本领 . 利用几何关系, 可以计算得到它的放大率 M 约为 5式( 1) 中, D 是明视距离 ; = L - f e- f o , 称为显微镜的光学距离; L 是显微镜的镜筒长; f e、f o 分别是物镜和目镜的焦距; e , o 分别是目镜和物镜的放大率.普通光学显微镜虽然实现了放大物体的目的, 但是由于它所成的像是倒立的 , 因此, 在实际操作过程中会不方便, 主要是不符合人们的一般习惯, 比如说在操作过程中定位所观察的标本时,操作的过程会和观察者看到的方向相反, 对于没有经过长时间训练的操作者或者不常使用显微镜的观察者来说会产生
13、很多不必要的麻烦,为了解决这一问题, 我们设计了成正立像的光学显微镜.显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像 AB。 AB靠近 F2 的位置上。再经目镜放大为虚像 AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 一、显微镜光学系统及其放大率 显微镜是由物镜和目镜组成（图 1.3） 。物镜先将物体 AB 形成一个倒立的
14、放大的实像AB，此像成在目镜的焦面内侧附近。然后通过目镜又形成一个放大的虚像 A“B“，按人眼观看物体的习惯，此虚像成在眼睛的明视距离处。由光学理论知道，显微镜的放大率是由物镜的放大率 （或称为放大倍数、线放大率、垂轴放大率）乘以目镜的视角放大率 。这里请注意 与 的区别。：光学筒长，物镜后焦点到目镜前焦点之间的距离。式（1.4）中 x为焦像距，物镜后焦点到像点之间的距离。显微物镜将像成在目镜前焦点附近，x 近似等于（见图 1.3） 。式（1.6）中的“- ”表示所成的像是倒立的。二、显微镜的机械筒长和光学筒长绝大多数显微镜的物镜和目镜各有数个组成一套，以便通过调换获得各种放大率。物镜的放大率
15、通常有：3、10、40 和 100 倍，目镜：6、10 和 16 倍。为了使用方便，多个物镜组装在一个可旋转的盘上，而目镜采用分个插入式。取下物镜和目镜所剩的镜筒壳，其长度称为机械筒长。为了能使物镜通用，我国规定显微镜的机械筒长为 160mm 和无穷大二种。适用机械筒长无穷大的物镜意味经物镜折射后的光线是平行光。光学筒长 为物镜后焦点到目镜前焦点之间的距离，此数据在式（1.4）中得到应用。物镜的物平面到像平面之间距离称为共轭距, 我国规定为 T=195mm。通常，显微物镜的放大率、数值孔径、机械筒长和所用盖玻片的厚度等 4 个数值标注在物镜的镜筒外壳上。例如某一物镜标注如下数据：40/0.65
16、 、 160/0.17，其含义是：物镜的放大率 40 倍、数值孔径 0.65，适用于机械筒长 160mm 的显微镜中，所用盖玻片的厚度为 0.17mm。三、物镜基本类型由于光学系统会产生各种像差，所以物镜与目镜大采用多片镜片组成来校正像差，以保证对成像质量的要求。像差分二类 7 种，它们是单色光类：球差、慧差、像散、场曲（像面弯曲）和畸变；复色光类：位置色差和倍率色差。根据显微物镜校正像差的情况不同，在通常消除球差和慧差等基本像差情况下，以消除色差和场曲的程度再分为消色差物镜、复消色差物镜和平视场物镜。消色差物镜是应用最广泛的一类显微物镜，它的特点是对红色光和蓝色光消除色差。 复消色差物镜主要
17、用于科学研究用显微镜及显微照相中，它的特点是对红色光、蓝色光及黄色光三种色光消除色差。平视场物镜是严格要求校正像面弯曲，使成像平面平直。2物镜的标志（1）物镜类别国产物镜，用物镜类别的汉语拼音字头标注，如平面消色差物镜标以“PC。西欧各国产物镜多标有物镜类别的英文名称或字头，如平面消色差物镜标以 “Planarchromatic 或 Pl”， 消色差物镜标以“Achromatic”，复消色差物镜标以 “Apochromatic” 。（2）物镜的放大倍数和数值孔径标在镜筒中央位置，并以斜线分开，如 10X/0.30， 45X/0.63，斜线前如 10X，45X 为放大倍数，其后为物镜的数值孔径如
18、 0.30，0.63。（3）适用的机械镜筒长度如 170，190，/0，表示机械镜筒长度（即物镜座面到目镜筒顶面的距离）为 170，190，无限长。0 表示无盖波片。（4）油浸物镜标有特别标注，刻以 HI,oil，国产物镜标有油或 Y。物镜的标志如图 7 所示。3目镜的类型目镜的作用是将物镜放大的象再次放大，在观察时于明视距离处形成一个放大的虚象，而在显微摄影时，通过投影目镜在承影屏上形成一个放大的实象。按象差分类的常用的几种物镜如下：（1）消色差及平面消色差物镜消色差物镜对象差的校正仅为黄、绿两个波区，使用时宜以黄绿光作为照明光源，或在入射光路中插入黄绿色滤色片，以使象差大为减少，图象更为清
19、晰。而平面消色差物镜还对象域弯曲进行了校正，使图象平直，边缘与中心能同时清晰成象。适用于金相显微摄影。（2）复消色差及平面复消色差物镜复消色差物镜色差的校正包括可见光的全部范围，但部分放大率色差仍然存在。而平面复消色差物镜还进一步作了象域弯曲的校正。（3）半复消色差物镜象差校正介于消色差和复消色差物镜之间，其它光学性质与复消色差物镜接近。但价格低廉，常用来代替复消色差物镜。Achromatic40X/0.65170（a） （b）图 7 物镜的性能标志（a）国产物镜 （b）Zeiss 公司物镜PC平场 Achromatic消色差10X放大倍数 40X放大倍数 0.30数值孔径 0.65数值孔径机
20、械镜筒长度 170机械镜筒长度0无盖波片PC10X/0.30/0目镜按象差校正及适用范围分类如下：（1）负型目镜(如福根目镜)由两片单一的平凸透镜在中间夹一光栏组成，接近眼睛的透镜称目透镜起放大作用，另一个称场透镜,使图象亮度均匀，未对象差加以校正，只适用于与低中倍消色差物镜配合使用。（2）正型目镜(如雷斯登目镜)与上述不同的是光栏在场透镜外面，它有良好的象域弯曲校正，球面象差也较小，但色差比较严重，同倍数下比负型目镜观察视场小。（3）补偿型目镜是一种特制目镜，结构较复杂，用以补偿校正残余色差，宜与复消色差物镜配合使用，以获得清晰的图象。（4）摄影目镜专用于金相摄影，不能用于观察，球面象差及象
21、域弯曲均有良好的校正。（5）测微目镜用于组织的测量，内装有目镜测微器，与不同放大倍数的物镜配合使用时，测微器的格值不同。4目镜的标志通常一般目镜上只标有放大倍数，如 7X，10X，12.5X 等，补偿型目镜上还有一个 K 字，广视域目镜上还标有视场大小。见图 8 所示。4.3 聚光镜聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径 0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。聚光镜光栏 图 8 目镜的标志（a）普通目镜 （b）广视域目镜5X放大倍数 WF广视域10X放大倍数
22、18MM视场大小WF10X18MM 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。聚光镜光栏作用（1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。（2）辅助调整亮度。四、显微镜照明系统用显微镜观察物体，大多为自身并不发光的标本，需要外界照明。照明系统主要包括光源、滤光器、聚光器和光阑。根据光源的不同可分为室内光照明、专用电光源照明；根据聚光器把光源成像的位置不同分为临界照明和柯拉照明；根据照明光透过物体进入物镜形成的反差类型分为明视场照明和暗视场照明等。1、 自然光照明 低挡的普通生物显微镜仅使用平面反射镜或凹面反射镜反射室内照明光或室外阳光直
23、接给标本照明。2、临界照明和柯拉照明图 1.4 临界照明光学系统 图 1.5 柯拉照明光学系统1 光源 2 聚光镜 3 聚光镜 1 聚光镜 3 可变视场光阑 4 可变视场光阑 5 物镜 4 标本台 5 聚光镜 6 标本台 7 物镜 8 物镜入瞳这类照明光源通常是设备自身携带的电光源，适用于透明物体的照明。临界照明(图 1.4)：光源经过聚光镜后，成像于被观察的物体平面上。这种照明系统的优点是光能利用率高，系统结构简单。但由于光源的像与物体面重合，光源本身亮度不均匀，所以带来照明亮度不均匀。柯拉照明(图 1.5)：光源经过聚光镜后，成像于物镜的入瞳处，在物面上形成一个均匀的亮体。它的优点是照明亮
24、度均匀。 缺点是光能损失较大，又其系统结构较为复杂。3、用暗视场来观察微粒的照明d图 1.6 透射光暗视场照明 图 1.7 落射光暗视场照明1 光源 2 聚光镜 3 滤光 4 暗视场聚光镜 1 聚光镜 2 反光镜 3 物镜5 标本台 6 物镜这类照明系统特点是用大孔径角照明标本，照明光束的主直射光被遮挡，仅让周围斜射光通过。由于物镜孔径相对照明系统孔径角要小，周围斜射光线不能进入物镜，视野是一片黑暗。但是若标本面上存在微粒，斜射光被微粒所衍射和散射，从而进入物镜成像，在黑暗的背景上形成了明亮的标本像。这就是暗视场照明的工作原理（图 1.6、图 1.7） 。 利用暗视场技术增加了图像的对比度，可
25、以观察到普通明视场中看不到的物体，如细菌、细胞活体等。同时，即使小于物镜分辨率的微粒，每个微粒的衍射光在暗背景中形成的各自彩色衍射光环，因此观察者们能觉察到微粒存在，这就是超微显微术的一种型式。 暗视场照明的优点：（1）能直接观察各种粒子。 （2）可提高显微镜分辨率，从普通显微镜分辨率约 0.4m 提高到 0.2-0.004m 的极小微粒。五、显微镜的分辨率和有效放大率根据瑞利判断原则，显微镜的分辨率由衍射中心光斑的半径确定。它主要取决于物镜的数值孔径 NA 之值大小，是显微镜的一个重要特性。通常用可辨别的样品上的两点间的最小距离 d 来表示，d 值越小，表示显微镜的鉴别能力越高。见图d d（
26、a） （b） （c）图 6 显微镜分辨率高低示意图(a)样品上两点之间距离 (b)低分辨率 (c)高分辨率显微镜的鉴别能力可用下式表示：d=2NA其中：入射光的波长，NA表示物镜的数值孔径。可见分辨率与入射光的波长成正比， 越短，分辨率越高。与数值孔径成反比，数值孔径 NA 越大，d 值越小，表明显微镜的鉴别能力越高。我们如用 = 0.5m 、NA=1.5 物镜数据代入式（1.2）中，得到：这个 0.2m 值就是在上述情景下显微镜的最小分辨距离，也就是显微镜的分辨率。采用不同的光波和数值孔径，就有不同的物镜分辨率，这是挑选显微物镜的重要依据。显微镜的有效放大率是这样考虑的：通常，人眼观察物体的
27、最小分辨的标准角度为1，考虑到较容易观察的要求，分辨角度放大到 2 4。在明视距离 250mm 处，2 4角度对应的距离为：250(20.00029)0.145 （mm）250(40.00029)0.291 （mm）(0.00029 是角度秒换算成弧度的系数 )这个数值与显微镜最小分辨距离 0 之比值即是显微镜有效放大率。用上式计算出的值0.2m 代入：按此计算，显微镜的有效放大率在 750 倍到 1500 倍之间。3.7 焦点深度 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。3.8 视场
28、数目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值3.9 工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。提高显微镜分辨率的方法：（1）增大物镜的数值孔径在物镜和盖玻片之间充以 n 较大的油，如香柏油 n =1.52,不仅使 n 增大，而且
29、孔径角 也增大。（2）用短波长的光照射如紫外光显微镜，电子显微镜。4物镜的数值孔径物镜的数值孔径用 NA 表示（即 Numderical Apertuer） ，表示物镜的聚光能力。数值孔径大的物镜，聚光能力强，即能吸收更多的光线，使图象更加介质(空气 n=1.0 实线) (油 n=1.52 虚线)明显，物镜的数值孔径 NA 可用公式表示为：NA=nsin 其中：n是物镜与样品间介质的折射率通过物镜边缘的光线与物镜轴线所成角度，即孔径半角。可见，数值孔径的大小，与物镜与样品间介质 n 的大小有关，以及孔径角的大小有关。见图 5 所示。当物镜与物体之间的介质为空气时，光线在空气中的折射率为 n=1
30、，若物镜的孔径半角为 30，则数值孔径为：NA=n sin=1sin30=0.5若物镜与物体之间的介质为松柏油时，介质的折射率 n=1.52,则其数值孔径为：NA=n sin=1.52sin30=0.76 物镜在设计和使用中,指定以空气为介质的称干系物镜或干物镜，以油为介质的称为油浸系物镜或油物镜。干物镜的 n=1，sin 值总小于 1，故数值孔径NA 小于 1，油物镜因 n=1.5 以上，故数值孔径 NA 大于 1。物镜的数值孔径的大小，标志着物镜分辨率的高低，即决定了显微镜分辨率的高低。显微镜的放大倍数物镜的放大倍数 M 物=A1B1/ABLF1目镜的放大倍数=A2B2/A1B1DF2两式
31、相乘：M 物M 目=A1B1/ABA2B2/A1B1=A2B2/AB=LF1DF2=L250 F1F2=M 总式中：L为光学镜筒长度（即物镜后焦点到目镜前焦点的距离）R2 R1 物镜 R1 R2=30R1 R2R2 R1AF1物镜的焦距。 F2目镜的焦距D明视距离（人眼的正常明视距离为 250mm）即显微镜总的放大倍数等于物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。一般金相显微镜的放大倍数最高可达 1600 到 2000 倍。由此可看出：因为 L 光学镜筒长度为定值，可见物镜的放大倍数越大，其焦距越短。在显微镜设计时，目镜的焦点位置与物镜放大所成的实象位置接近，并使目镜所成的最终倒立虚象在距眼睛 250
32、 毫米处成象，这样使所成的图象看得很清楚。显微镜的主要放大倍数一般通过物镜来保证，物镜的最高放大倍数可达100 倍，目镜的最高放大倍数可达 25 倍。放大倍数分别标注在物镜和目镜各自的镜筒上。在用金相显微镜观察组织时，应根据组织的粗细情况，选择适当的放大倍数，以使组织细节部分能观察清楚为准，不要只追求过高的放大倍数，因为放大倍数与透镜的焦距有关，放大倍数越大，焦距越小，会带来许多缺陷。3透镜象差：透镜象差就是透镜在成象过程中，由于本身几何光学条件的限制，图象会产生变形及模糊不清的现象。透镜象差有多种，其中对图象影响最大的是球面象差、色象差和象域弯曲三种。显微镜成象系统的主要部件为物镜和目镜，它
33、们都是由多片透镜按设计要求组合而成，而物镜的质量优劣对显微镜的成象质量有很大影响。虽然在显微镜的物镜、目镜及光路系统等设计制造过程中，已将象差减少到很小的范围，但依然存在。（1）球面象差：1）产生原因：球面象差是由于透镜的表面呈球曲形，来自一点的单色光线，通过透镜折射以后，中心和边缘的光线不能交于一点，靠近中心部分的光线折射角度小，在离透镜较远的位置聚焦，而靠近边缘处的光线偏折角度大，在离透镜较近的位置聚焦。所以形成了沿光轴分布的一系列的象，使图象模糊不清。这种象差称球面象差，见图 2 所示。图 2 球面象差示意图A2）校正方法：a 采用多片透镜组成透镜组，即将凸透镜与凹透镜组合形成复合透镜，
34、产生性质相反的球面象差来减少。b 通过加光栏的办法，缩小透镜的成象范围。因球面象差与光通过透镜的面积大小有关。在金相显微镜中，球面象差可通过改变孔径光栏的大小来减小。孔径光栏越大，通过透镜边缘的光线越多，球面象差越严重。而缩小光栏，限制边缘光线的射入，可减少球面象差。但光栏太小，显微镜的分辨能力降低，也使图象模糊。因此，应将孔径光栏调节到合适的大小。（2）色象差：1）产生原因：色象差的产生是由于白光是由多种不同波长的单色光组成，当白光通过透镜时，波长愈短的光，其折射率愈大，其焦点愈近。而波长越长，折射率越小， 其焦点愈远，这样一来使不同波长的光线，形成的象不能在同一点聚焦，使图象模糊所引起的象
35、差，即色象差。见图3 所示。2）校正方法：可采用单色光源或加滤色片或使用复合透镜组来减少。（3）象域弯曲：1）产生原因：垂直于光轴的平面，通过透镜所形成的象，不是平面而是凹形的弯曲象面。称象域弯曲。见图 4 所示。2）校正办法：象域弯曲的产生，是由于各种象差综合作用的结果。一般的物镜或多或少地存在着象域弯曲，只有校正极佳的物镜才能达到趋于平坦的象域。图 3 色象差示意图第二节 光学显微术装置及其显微镜生物及医用显微镜可分为普通型生物显微镜、特种型生物显微镜和高级型生物显微镜。普通型生物显微镜仅供一般用途，普通医用显微镜、倒置显微镜均属此类。特种型生物显微镜可作某些专门观察和研究用，暗视场生物显
36、微镜、荧光显微镜、相衬显微镜等均属于此类。激光扫描共聚焦显微镜是 80 年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，广泛应用在各行各业上。以下简单介绍几种特种型生物显微镜的工作原理。2.1 落射光显微镜显微镜的照明光从观察者一侧沿物镜光轴方向照射到物体表面，并由其反射回到物镜成像的显微镜称为落射光显微镜。落射光有二种可能性：一、专用落射光物镜：这种物镜的镜体分内外两层套筒。内层是专用于紫外光线的石英物镜，外围有一圈环形反光镜。照明光束由环形反光镜向下照射到物体，由物体反射的光进入物镜成像（图 1.7 ） 。二、由分色滤光镜和物镜组成（图 1.13 ）：用分色滤光镜做到入射光路和反射光路共轴
37、，这时物镜即有聚光镜功能又是成像的物镜，在6 中将要介绍的荧光显微镜就属于此类。分色滤光镜是在玻璃上喷镀了一层金属膜或多层介质膜，使入射光线一半能量透过而另一半被反射。2.2 暗视场显微镜暗视场显微技术是暗视场照明，其关键部件是暗视场聚光镜，在第一章已有叙述。从照明方式可分为落射光照明和透射光照明。图 1.6、1.7 中示出的暗视场聚光镜就是众多种的几种。2.3 偏振光显微镜图 4 象域弯曲示意图BAAB偏振光显微镜是利用光的波动性来观察和测量标本的细节变化，判别物质结构的一种显微镜。这种偏振光显微镜在生物学领域中可以鉴定生物结晶的性质、膜结构的分子排列、生物膜的厚度等。普通显微镜采用自然光照
38、明。从波动学的角度来讲，自然光的波是各个方向所取向的振动面能量均相等，无占优势。而从自然光中分离出来具有特定取向的振动面的光称为偏振光，如果仅只有一个振动面的光叫完全偏振光或线偏振光。偏振光的获得通常有二种办法。一种是利用晶格整齐排列的薄膜，晶格排列的方向称偏振轴，它仅让光线与偏振轴平行振动面的光波通过，而与其垂直方向的光波都被吸收。另一种是利用晶体各向异性的特点，来获得偏振光。透明介质按其光学特性可分为各向同性介质和各向异性介质。所谓各向同性介质是指光线通过它时，各振动方向的光波传递速度是相同的，而各向异性介质是不同振动方向有不同速度。用各向异性晶体制成特定形状的棱镜，当一束光线通过这种棱镜
39、时，会被分解成二束振动方向相互垂直的线偏振光，从而获得偏振光。由于前一种方法结构简单、价格低，目前得到广泛应用。把用途不同的偏振镜片分为起偏镜片和检偏镜片。起偏镜片是将自然光滤成偏振光，而检偏镜片是检测光线的偏振性质，通常是把起偏镜片和检偏镜片组合使用。当起偏镜片方向与检偏镜片的方向互相平行时，通过起偏镜片的光也能通过检偏镜片，这时所观察的视野为最亮。当两者的偏振轴方向相互垂直，又称为正交，那么，通过起偏镜片的光，则被检偏镜吸收，不能通检偏镜片，观察视野为最暗（图 1.8 ） 。在正交的起偏镜片和检偏镜片中加一被检的偏振镜片，而此偏振镜片的偏振轴方向与起偏镜片和检偏镜片的偏振轴都不相同，那么破
40、坏了原来的正交性，观察的视野出现亮光。图 1.8 光的偏振试验生物标本的细节具有极为复杂的光学特性，有各向同性的，也有各向异性，有的结构受到外界影响从各向同性转向各向异性，出现双折射现象，这些现象就可以利用偏振光显微镜给予观察。图 1.9 所示的偏振光显微镜就是利用生物标本的细节具有各向异性而观察的。在起偏镜片和检偏镜片的偏振轴方向正交垂直的情况下，中间安插一被检标本，而标本具有各向异性特点时，改变了由起偏镜决定偏振光的方向，破坏了与检偏镜正交垂直的特性，光线就从检偏镜片透过，通过目镜可以观察到生物标本细节的明暗变化情况。在偏振光显微镜中按装了 1/4 波（晶）片（图 1.9） 。它的作用是使
41、偏振光线经晶片后，振动光波的位相增大了 1/4 波长，也就是偏振角附加旋转了 45。从而使偏振方向仅有微小变化的样本得到放大，增大标本细节上的差异，便于观察。波（晶）片是由沿光轴平行方向切割的适当厚度的云母、方解石或水晶等晶体制成，用晶片的厚度来控制出射光的相位差。1 光源 2 起偏镜片 3 光阑 4 聚光镜5 标本 6 物镜 7 14 波片 8 检偏镜片 9 目镜2.4 相衬显微镜在观察生物及其它一些标本时，常会遇到与周围介质具有同样吸收系数和颜色，而折射率或厚度稍有不同的物体，我们称之为位相物体。用普通的显微镜观察难以看清，如加以染色，会杀死许多标本活体，影响观察效果。相衬显微镜是利用光的
42、衍射和干涉原理，增大标本细节上折射率的差异，来显现出标本细节的图像。标本细节的图像。如图 1.10 所示，有一块透明的平行平板，在中间有一小部份的折射率为 n1， 其余均为 n 。今用相干的平行光束 1 和光束 2 直射，光束 2 通过 n 1 的部份与光束 1 通过 n 的部份，它们的光程相差（n - n 1）d。当这二束光线相遇，就会产生干涉，其光能量加大或减小。但是如果仅靠此，由于这二部份光的振幅（能量）相差很大，相位差异很小，在像平面上无法显示清晰的图形，应用相衬显微镜可以解决以上二个缺陷。图 1.11 是相衬显微镜的原理图。 在光源和聚光镜之间加一个环状光阑，而环状光阑经聚光镜成像在
43、位相板上，正好与位相板上的介质组成的圆环重合。由于位相板的作用，使直射光的位相滞后 /2，或使衍射光位相滞后 /2，同时使直射光光强大幅度下降，与衍射光相当，这样二束干涉光强与周围光强就明显分开，图形看的很清晰了。衍射光位相滞后 /2 称为正相衬，位相板的环形部份仅起吸收直射光能量的作用，而其余通光部份则起到改变位相的作用。直射光的位相滞后 /2 称为负相衬，位相板的环形部份除了起吸收直射光能量的作用外，同时还改变直射光的位相。相衬显微镜关键部件有：一、环状光阑环状光阑是在玻璃片上喷涂金属薄膜借以挡光，只留下环形透光窄缝的光阑。环状光阑被安装在聚光镜物方焦平面上，以产生相干光源的窄缝。二、位相
44、板位相板是用金属来吸收部份光能，并用介质使部份的光产生相位滞后，从而增大与衍射光的相位差。三、对中望远镜（合轴望远镜）对中望远镜用以校正环形光阑中心、相位板中心与物镜光轴在一条直线上。把对中望远镜插入目镜筒内，可观察到环形光阑与相位板的像，利用转盘上的调节中心螺钉，可使环形光阑与相位板套准，绝对不能相互偏离，也不能大小不一。2.5 干涉相衬显微镜干涉相衬显微镜是在利用偏振光观察标本各向异性物质的现象基础上，再利用偏振光的干涉现象进一步提高图像的对比度和清晰度。图 1.12 示出干涉相衬显微镜光路原理图。从起偏镜出射的线偏振光通过渥拉斯顿棱镜之后，被剪切成振动方向互相垂直的两束线偏振光。经聚光镜
45、后，两线偏振光以横向位移 的平行光透过标本，然后经物镜在其后焦面聚焦，诺曼斯基棱镜的干涉场正好处于物镜的后焦面。经过诺曼斯基镜后，两偏振光又会合在一起，而偏振方向仍互相垂直，故不能干涉，但经过检偏镜后，振动方向一致了，于是在中间像面上形成干涉图像，可用目镜观察。 （渥拉斯顿棱镜、诺曼斯基棱镜是由晶体制作的偏振棱镜）图 1.12 干涉相衬显微镜1 起偏镜 2 渥拉斯顿棱镜 3 聚光镜 4 标本 5 物镜 6 诺曼斯基棱镜 7 检偏镜 8 中间像面 2.6 荧光显微术和荧光显微镜利用特定的光照射经荧光色素处理的标本受激而产生荧光，以观察组织、细胞微小结构的技术称为荧光显微术。根据成像光路的特点，荧
46、光显微镜可分为透射光荧光显微镜和落射光荧光显微镜。图 1.13 给出落射光荧光显微镜的光路原理图。见图 1.13，由光源 1 发出的光线经聚光镜 2 会聚，通过激发滤光片 3 后仅有某一指定波段的光束，通过二向性分光镜 4 及物镜 5 照射标本 6。通常标本 6 是经过荧光染色处理的，在某指定波长的光束照射下，会被激发出相对应波长的荧光，然后再经物镜 5、二向性分光镜 4、与抑止滤光片 7 成像在目镜 8 的前焦面处供观察。激发滤光片与抑止滤光片是仅让某指定波长的光通过，二向性分光镜是让短于某指定波长的光反射而长于此波长的光透过。一、荧光显微镜的优点：1、采用紫外光，可提高显微镜分辨率。2、荧
47、光显微镜能直接显示细胞内生物化学成份，并且显示很辉煌的彩色效果，极易观察，极易进行定量分析。3、荧光显微术又是一种显示标记物质如标志荧光抗体的先进的特异性示踪技术。4、荧光用量少，对活细胞毒性极小，可进行活体分析。5、显色效果好。6、方法筒便、易行，得出结果非常迅速，适用于医学临床诊断技术。二、对各组件的要求：1、光源 荧光显微镜的光源需含有丰富的激发荧光物质的光谱，通常采用超高压汞灯、超高压氙灯或卤钨灯。2、照明方式 透射荧光显微镜宜选用暗视场照明，暗的背景能使图像的对比度好，并可降低对滤光片组的要求。落射荧光显微镜大多采用柯勒照明。3、物镜 为了能得到更多的光能，和避免杂散荧光产生，显微镜
48、的物镜大多采用大孔径复消色差的石英物镜。石英物镜是用石英材料制成的镜头，它能在紫外光线照射下不会产生荧光现象。4、浸液 在激发光的照射下，镜头浸液必须不会产生荧光现象，常用的浸液有蒸馏水、硅油、甘油及无荧光油等。所选用的浸液折射率也必须与物镜的要求相符，否则会影响成像质量。5、滤光片组 滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长二向性分光滤光片的透射波长抑止滤光片的透射波长（图 1.14） 。通常，仪器生产厂家已经把搭配好的滤光片固定在支架上，用时只需按要求选择滤光片组就可以了。 图 1.14 滤光片组的选择.7 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜是利用激光通过照明针孔形成的点光源，经物镜成像与标本平面上，标本平面的工作台作 x-y 二维空间移动，激光点在标本每一点上照射扫描，标本上被照射点又经原物镜在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管或冷电感合器件逐点或逐线接收，即时在计算机监视器屏幕上形成图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的
