1、显微镜显微镜一般分为：光学显微镜、电子显微镜、探针显微镜1.光 学 显微 镜 ：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。结 构 为 ： 目 镜 ，镜 筒 ， 转 换 器 ，物 镜 ， 载 物 台 ，通 光 孔 ， 遮 光器 ， 压 片 夹 ，反 光 镜 ， 镜 座 ，粗 准 焦 螺 旋 ，细 准 焦 螺 旋 ，镜 臂 ， 镜 柱 ，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定 不变的。而光学系统由 物镜、目镜、聚光器等 组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都
2、可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。光学显微镜的原理：当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点“，通过交点并垂直光轴的平面，称“焦平面“。焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点“，该处的焦平面，称“物方焦平面“；反之，在象方空间的焦点，称“象方焦点“，该处的焦平面，称“象方焦平面“。 1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；图 1-1-13. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时
3、，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。这是凸透镜成像的基本原理，把物镜与管镜合称为物镜，将这两种镜片看做一组组合透镜，就可以得到如图的简化光路图即，物体 AB 位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外，在象方二倍焦距以外形成了放大的倒立实象 A1B1而这个实像落在了目镜的焦点以内，就在物体的同侧形成了一个放大的“正立”的虚像，因为目镜放大的并不是物体而是由物镜放大后的倒立实像，因此我们得到的就是相对与原物体的倒立放大的虚像。显微镜对物体的放
4、大，实际上就是对人观察物体时视角的放大，因此显微镜的放大率取决于对视角的放大率如果有一台显微镜，物镜焦距为 ，1f目镜焦距为 ，镜筒长 L，若最后的像成在离目镜 d 处，试证明显微镜的放大率2f。21fLdm显微镜的光路如图 1-1-2 所示， AB 经物镜成一放大实像 ，物镜的长度放大率1BA11BOA因 、 相对 L 都较小。而且 B 很靠近 ，所以1f2 1F，OBf1即 1/fm位于目镜的焦点内，经目镜成一放大的虚像 （通常让 成在观察者的明A 2BA2dLAB2 1B2OF1F1A2A1O图 1-1-2视距离 d 上） 。因为都是近轴光线，所以此时观察者从目镜中看到 的视角 为2BA
5、21212tanfBAOd若观察者不用显微镜，直接观看 AB 的视角 为dBtan则显微镜的放大率 m2121fLABf不难看出目镜的长度放大率为22/fdm所以有 1显微镜的重要光学技术参数显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1 数值孔径数值孔径简写 NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是
6、物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2孔径角又称“镜口角“，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大 NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率 n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率 n 值大于 1，NA值就能大于 1。数值孔径最大值为 1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为 1.66,所以 NA 值可大于
7、1.4。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的 NA 值应等于或略大于物镜的 NA 值。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA 值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。2 分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率“。其计算公式是 =/NA式中 为最小分辨距离； 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的 NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小 值
8、，可采取以下措施（1） 降低波长 值，使用短波长光源。（2） 增大介质 n 值以提高 NA 值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角 u 值以提高 NA 值。（4） 增加明暗反差。3 放大率和有效放大率由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率 应该是物镜放大率 和目镜放大率 1 的乘积：=1显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA1000NA
9、当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。 4 焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，
10、焦深与其他技术参数有以下关系：（1） 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。（2） 焦深大，分辨率降低。 由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。5 视场直径（Field Of View）观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。有公式 F=FN/式中 F: 视场直径，FN：视场数（Field Number, 简写为 FN，标刻在目镜的镜筒外侧），:物镜放大率。由公式可看出：（1） 视场直径与视场数成正比。（2）
11、 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。6 覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为 0.17mm，许可范围在 0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的 0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。 7 工作距离 WD工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的
12、一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。物镜物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准。1 物镜的主要参数（1） 放大率 （2） 数值孔径 NA（3） 机械筒长 L：在显微镜中，物镜支承面到目镜支承面之间的距离称为机械筒长。对于一台显微镜来说，机械筒长是固定的。我国规定机械筒长是 160 毫米。（4） 盖玻片厚度 d（5） 工作距离 WD这些参数，大多刻在物镜筒上，
13、如图 3 所示。有一种所谓筒长无限的显微物镜，这种物镜的后方一般带有辅助物镜（也叫补偿物镜或镜筒物镜），被观察物体位于物镜前焦点上，经过物镜以后，成像在无限远，再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上，如图 4 所示。在物镜和辅助物镜之间是平行光，所以中间距离比较自由一些，可以加入棱镜等光学元件。物镜的基本类型（1） 按显微镜镜筒长度（以 mm 计）：透射光用 160 镜筒，带 0.17mm 厚或更厚的盖玻片；反射光用 190 镜筒，不带盖玻片；透射光与反射光用镜筒，筒长无限大。（2） 按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。（3） 按光学装置：透射式、反射式以及折反射
14、式。（4） 按数值孔径和放大倍数：低倍(NA0.2 与 10X)，中倍(NA0.65 与 40X)，高倍(NA0.65 与 40X)。（5） 按校正象差的情况不同，通常分为消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。a. 消色差物镜（Achromatic objective）这是应用最广泛的一类显微物镜，外壳上常有“Ach“字样。它校正了轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（黄绿光）和正弦差，保持了齐明条件。轴外点的象散不超过允许值(4属光度)，二级光谱未校正。数值孔径为 0.10.15 的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值
15、孔径至 0.2 的消色差物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到 0.3 时，再加入一平凸透镜，该平凸透镜决定着物镜的焦距，而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式，由四部分构成：前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。b. 复消色差物镜（Apochromatic objective）这类物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有“Apo“字样。它对两个色光实现了正弦条件，要求严格地校正轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（红，蓝二色）和正弦差，同时要求校正二级光谱（再校正绿光的位置色差）。其倍率色差并不能
16、完全校正，一般须用目镜补偿。由于对各种象差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相。c. 半复消色差物镜（Semi apochromatic objective）半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜的外壳上标有“FL“字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比复消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。d. 平视场物镜（Plan objective ）平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的
17、。平场物镜的视场平坦，更适用于镜检和显微照相。对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜，则必须用目镜来补偿它的倍率色差。e. 单色物镜这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。只能在紫外线光谱区的个别区内使用(宽度不超过 20mm)，可见光谱区不能采用单色物镜。这类物镜均制成反射式与折反射式系统。主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面积的 25%)。在新型折反射系统中，由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构，使这一缺点大为减轻，从而可以取消反射镜框的遮光。并且两同轴反射镜的残余象差是互相补偿的，同时用透镜组来增大数值孔径。若系统的校正满意，
18、孔径达到 NA=1.4 时，中心遮蔽可不超过入瞳面积的 4%。f. 特种物镜所谓“特种物镜“是在上述物镜的基础上，专门为达到某些特定的观察效果而设计制造的。主要有以下几种： (a) 带校正环物镜（Correction collar objective）在物镜的中部装有环装的调节环，当转动调节环时，可调节物镜内透镜组之间的距离，从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。调节环上的刻度可从 0 .11-.023,在物镜的外壳上也标科有此数字，表明可校正盖玻片从 0.11-0.23mm 厚度之间的误差。(b) 带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective）在物镜镜筒内的上部装有虹
19、彩光阑，外方也可以旋转的调节环，转动时可调节光阑孔径的大小，这种结构的物镜是高级的油浸物镜，它的作用是在暗视场镜检时，往往由于某些原因而使照明光线进入物镜，使视场背景不够黑暗，造成镜检质量的下降。这时调节光阑的大小，使背景变黑，使被检物体更明亮，增强镜检效果。 (c) 相衬物镜（Phase contrast objective）这种物镜是由于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦平面处装有相板。(d) 无罩物镜（No cover objective）有些被检物体，如涂抹制片等，上面不能加用盖玻片，这样在镜检时应使用无罩物镜，否则图象质量将明显下降，特别是在高倍镜检时更为明显。这种物镜的外壳
20、上常标刻 NC，同时在盖玻片厚度的位置上没有 0.17 的字样，而标刻着“0“。(e) 长工作距离物镜这种物镜是倒置显微镜的专用物镜，它是为了满足组织培养，悬浮液等材料的镜检而设计。对于一个显微镜，目镜只起一个放大的作用，分辨率等等参数都是由物镜直接决定的。物镜的鉴别能力：显微镜的鉴别能力主要决定于物镜。物镜的鉴别能力可分为平面和垂直鉴别能力。平面鉴别能力即物镜的分辨率是指物镜所具有的将显微组织中两物点清晰区分的最小距离 d 的能力。如 1-5 所示。 根据光学衍射理论可知，显微组织中的一点经物镜放大成像后并不能获得一个真正的点像，而是具有相应尺寸的以白色圆斑为中心的许多个同心衍射环组成的。中
21、心光斑的强度最大，而衍射环的光强度随着环直径增大而逐渐减弱。试样上若有两个点，如果两点之间的距离小于 d，则两点放大成像后的衍射环中心部分也相互重迭而不能清晰分辨。只有当两点间距大于或等于图 1-5 鉴别率与衍射环d 才能清晰地分辨出来。d 即为物镜的分辨能力（鉴别率） 。两物点间最小距离 d 愈小，物镜的分辨能力愈高。d=/2NA式中 入射光的波长；NA物镜的数值孔径。在显微镜中，能充分利用物镜分辨率的最低放大倍数称为有效放大倍数。人眼在明视距离（250mm）处的分辨距离为 0.150.30mm，因此，显微镜应将物镜能分辨的最小距离d 放大到 0.150.30mm 时方使其被人眼所分辨。若以
22、 Ma 表示显微镜的有效放大倍数，则dMa=0.150.30mmMa=(0.30.6)NA/由此可知，显微镜的有效放大倍数是由物镜的数值孔径和入射光的波长决定的。若用黄绿色光（5.5 10-1mm）观察，则Ma=（5001000）NA例如：选用 NA=0.65 的 40 倍物镜，若入射光波长 5.510-1mm 时，则Ma=（5001000）NA=325650 倍表 1-2 物镜的最小数值孔径系列、参数、色圈及标志因此，应选择 1020 倍目镜相配合。如目镜倍数低于 10 倍，则未能充分发挥物镜的分辨能力；如果目镜倍数高于 20 倍，将会产生虚放大。垂直鉴别能力即物镜垂直分辨率又称景深，是指物
23、镜所具有在景深方面能清晰造像的能力，即垂直方面能清晰造像的最大景深深度，深度越大表示垂直鉴别率越大。景深 h 为: h=n/(NA)M（0.150.30）由此可见，物镜的垂直鉴别率与数值孔径、放大倍数成反比，要提高景深，最好选用数值孔径小的物镜或减小孔径光阑以缩小物镜的工作孔径，但这样就会降低物镜的分辨能放大倍数分类，色圈 1.6 2.5 4 6.3 10 16 25 40 50 63 80 100 代号消色差物镜 0.10 0.25 0.40 0.65 0.85 1.25 平面消色差物镜 0.04 0.07 0.10 0.15 0.25 0.32 0.40 0.65 0.75 0.85 0.
24、95 1.25 PC平面半复消色差物镜 0.20 0.30 0.40 0.60 0.75 0.90 1.30 PB平面复消色差物镜数值孔径 0.16 0.20 0.30 0.40 0.65 0.80 0.95 1.32 PF色圈 黑 黑 蓝 蓝 紫 绿 绿 黄 黄 红 红 白力.。所以要调和这一矛盾只能视具体情况而定。显微镜的鉴别能力显微镜的鉴别能力是显微镜最重要的特性，它是指显微镜对于试样上最细微部分所能获得清晰映象的能力，通常用可以辨别的物体上两点间的最小距离 d 来表示。被分辨的距离越短，表示显微镜的鉴别能力越高。显微镜的鉴别能力可由下式求得：d=/2NA式中：入射光源的波长；NA物镜的
25、数值孔径，表示物镜的聚光能力。可见，波长越短，数值孔径越大，鉴别能力就越高，在显微镜中就能看到更细微的部分。一般物镜与物体之间的介质是空气，光线在空气中的折射率 n=1，若一物镜的角孔径为 60，则其数值孔径为NA=nsin=1sin30=0.5若在物镜与试样之间滴入一种松柏油（n=1.52） ，则其数值孔径为：NA=1.52sin30=0.76物镜在设计和使用中指定以空气为介质的称为“干系物镜” （或干物镜） ，以油为介质的称为“油浸系物镜” （或油物镜） 。从图 1-7 可以看出，油物镜具有较高的数值孔径，因为透过油进入到物镜的光线比透过空气进入的多，使物镜的聚光能力增强，从而提高物镜的鉴
26、别能力。（a）干物镜 （b）油物镜图 1-7 不同介质对物镜聚光能力的比较以上是光学显微镜一些重要的性质与光学原理，以下是光学显微镜几种特殊情况，或者说具有更特异性功能的光学显微镜：暗视野显微镜物镜 物镜试样 试样R2R1 R1R2R1 R1R2 R2=300 空气n=1 油n=1.52明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜（图 2-9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地
27、显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。相差显微镜 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人
28、肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。它比 通 常 的 显 微 镜 要 增 加 下 列 附 件 ： (1) 装 有 相 位 板 (相 位 环 形 板 )的 物 镜 ， 相 位 差 物 镜 。 (2) 附 有 相 位 环 (环 形 缝 板 )的 聚 光 镜 ，
29、 相 位 差 聚 光 镜 。 (3) 单 色 滤 光 镜 -(绿 )。 各 种 元 件 的 性 能 说 明 (1) 相 位 板 使 直 接 光 的 相 位 移 动 90， 并 且 吸 收 减 弱 光 的 强 度 ， 在 物 镜 后 焦 平 面的 适 当 位 置 装 置 相 位 板 ， 相 位 板 必 须 确 保 亮 度 ， 为 使 衍 射 光 的 影 响 少 一 些 ， 相 位 板 做 成环 形 状 。 (2) 相 位 环 (环 状 光 圈 )是 根 据 每 种 物 镜 的 倍 率 ， 而 有 大 小 不 同 ， 可 用 转 盘 器 更 换 。 (3) 单 色 滤 光 镜 系 用 中 心 波
30、长 546nm(毫 微 米 )的 绿 色 滤 光 镜 。 通 常 是 用 单 色 滤 光镜 入 观 察 。 相 位 板 用 特 定 的 波 长 ， 移 动 90看 直 接 光 的 相 位 。 当 需 要 特 定 波 长 时 ， 必须 选 择 适 当 的 滤 光 镜 ， 滤 光 镜 插 入 后 对 比 度 就 提 高 。 此 外 ， 相 位 环 形 缝 的 中 心 ， 必 须 调整 到 正 确 方 位 后 方 能 操 作 ， 对 中 望 远 镜 就 是 起 这 个 作 用 部 件 。荧光显微镜有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照
31、射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。在萤 光 显 微 镜 上 ， 必 须 在 标 本 的 照 明 光 中 ， 选 择 出 特 定 波 长 的 激 发 光 ， 以 产 生 荧 光 ， 然 后必 须 在 激 发 光 和 荧 光 混 合 的 光 线 中 ， 单 把 荧 光 分 离 出 来 以 供 观 察 。 因 此 ， 在 选 择 特 定 波长 中 ， 滤 光
32、 镜 系 统 ， 成 为 极 其 重 要 的 角 色 。 荧 光 显 微 镜 原 理 ： (A) 光 源 ： 光 源 辐 射 出 各 种 波 长 的 光 (以 紫 外 至 红 外 )。 (B) 激 励 滤 光 源 ： 透 过 能 使 标 本 产 生 萤 光 的 特 定 波 长 的 光 ， 同 时 阻 挡 对 激 发 萤 光 无用 的 光 。 (C) 荧 光 标 本 ： 一 般 用 荧 光 色 素 染 色 。 (D) 阻 挡 滤 光 镜 ： 阻 挡 掉 没 有 被 标 本 吸 收 的 激 发 光 有 选 择 地 透 射 荧 光 ， 在 荧 光 中 也有 部 分 波 长 被 选 择 透 过 。 以
33、 紫 外 线 为 光 源 ， 使 被 照 射 的 物 体 发 出 荧 光 的 显 微 镜 。偏 光 显 微 镜偏 光 显 微 镜 是 用 于 研 究 所 谓 透 明 与 不 透 明 各 向 异 性 材 料 的 一 种 显 微 镜 。 凡 具 有 双 折 射的 物 质 ， 在 偏 光 显 微 镜 下 就 能 分 辨 的 清 楚 ， 当 然 这 些 物 质 也 可 用 染 色 法 来 进 行 观 察 ， 但有 些 则 不 可 能 ， 而 必 须 利 用 偏 光 显 微 镜 。 （ 1） 偏 光 显 微 镜 的 特 点 将 普 通 光 改 变 为 偏 振 光 进 行 镜 检 的 方 法 ， 以 鉴
34、别 某 一 物 质 是 单 折 射 （ 各 向 同 行 ） 或双 折 射 性 （ 光 束 入 射 到 各 向 异 性 的 晶 体 ， 分 解 为 两 束 光 而 沿 不 同 方 向 折 射 的 现 象 。它 们 为 振 动 方 向 互 相 垂 直 的 线 偏 振 光 。 这 样 的 晶 体 可 以 理 解 为 不 均 匀 介 质 ） 。 双 折 射性 是 晶 体 的 基 本 特 性 。 因 此 ， 偏 光 显 微 镜 被 广 泛 地 应 用 在 矿 物 、 化 学 等 领 域 ， 在 生 物 学和 植 物 学 也 有 应 用 。 （ 2） 偏 光 显 微 镜 的 基 本 原 理 偏 光 显 微
35、 镜 的 原 理 比 较 复 杂 ， 在 此 不 作 过 多 介 绍 ,偏 光 显 微 镜 必 须 具 备 以 下 附 件 ：起 偏 镜 ， 检 偏 镜 ， 补 偿 器 或 相 位 片 ， 专 用 无 应 力 物 镜 ， 旋 转 载 物 台 。共 聚 焦 显 微 镜从 一 个 点 光 源 发 射 的 探 测 光 通 过 透 镜 聚 焦 到 被 观 测 物 体 上 ， 如 果 物 体 恰 在 焦 点上 ， 那 么 反 射 光 通 过 原 透 镜 应 当 汇 聚 回 到 光 源 ， 这 就 是 所 谓 的 共 聚 焦 ， 简 称 共 焦 。 激光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 Confocal
36、Laser Scanning Microscope(CLSM 或 LSCM)在 反 射 光的 光 路 上 加 上 了 一 块 半 反 半 透 镜 (dichroic mirror)， 将 已 经 通 过 透 镜 的 反 射 光 折 向 其 它方 向 ， 在 其 焦 点 上 有 一 个 带 有 针 孔 (Pinhole)， 小 孔 就 位 于 焦 点 处 ， 挡 板 后 面 是 一 个 光 电 倍 增 管 (photomultiplier tube， PMT)。 可 以 想 像 ， 探 测 光 焦 点 前 后 的 反 射 光 通 过 这一 套 共 焦 系 统 ， 必 不 能 聚 焦 到 小 孔
37、上 ， 会 被 挡 板 挡 住 。 于 是 光 度 计 测 量 的 就 是 焦 点 处 的反 射 光 强 度 。 其 意 义 是 ： 通 过 移 动 透 镜 系 统 可 以 对 一 个 半 透 明 的 物 体 进 行 三 维 扫 描 。金 相 显 微 镜金 相 显 微 镜 是 对 金 属 内 部 结 构 进 行 分 析 与 鉴 定 的 显 微 镜 ， 对 镜 片 要 求 较 高 。 上 面 提 到的 滤 光 镜 片 等 等 参 数 实 际 上 是 在 金 相 显 微 镜 中 的 细 致 要 求 ， 一 般 的 生 物 学 观 测 并 不 局 限于 上 面 的 细 致 的 规 定 ， 但 成 像
38、 原 理 并 无 区 别2.电子显微镜透 射 电 子 显 微 镜图 1.2 透射电子显微镜的光路原理图 图 1.3因 电 子 束 穿 透 样 品 后 ， 再 用 电 子 透 镜 成 像 放 大 而 得 名 。 ， 由 于 电 子 束 的 穿 透 力 很 弱 ，因 此 用 于 电 镜 的 标 本 须 制 成 厚 度 约 50nm 左 右 的 超 薄 切 片 。 这 种 切 片 需 要 用 超 薄 切 片机 制 作 。 电 子 显 微 镜 的 放 大 倍 数 最 高 可 达 近 百 万 倍 、 由 照 明 系 统 、 成 像 系 统 、 真 空系 统 、 记 录 系 统 、 电 源 系 统 5 部
39、 分 构 成 ， 如 果 细 分 的 话 ： 主 体 部 分 是 电 子 透 镜 和 显像 记 录 系 统 ， 由 置 于 真 空 中 的 电 子 枪 、 聚 光 镜 、 物 样 室 、 物 镜 、 衍 射 镜 、 中 间 镜 、 投 影 镜 、 荧 光 屏 和 照 相 机 。电子光学部分整个电子光学部分完全置于镜筒之内，自上而下顺序排列着电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、观察室、荧光屏、照相机构等装置。根据这些装置的功能不同又可将电子光学部分分为照明系统、样品室、成像系统及图像观察和记录系统。图 1.3 为透射电子显微镜电子光学部分示意图。1 照明系统照明系统由电子枪、聚光镜和相
40、应的平移对中及倾斜调节装置组成。它的作用：是为成像系统提供 一束亮度高、相干性好的照明光源。为满足暗场成像的需要照明电子束可在2-3 度范围内倾斜。电子枪。它由阴极、栅极和阳极构成。 在真空中通电加热后使从阴极发射的电子获得较高的动能形成定向高速电子流。聚光镜。聚光镜的作用是会聚从电子枪发射出来的电子束，控制照明孔径角、电流密度和光斑尺寸。2 样品室图 1.4 照明系统示意图样品室中有样品杆、样品杯及样品台。其位于照明部分和物镜之间，它的主要作用是通过试样台承载试样，移动试样。 3 成像系统一般由物镜、中间镜和投影镜组成。中间镜和投影镜的作用是将来自物镜的图像进一步放大。成像系统补充说明：a)
41、 由物镜、中间镜(1、2 个)和投影镜(1、2 个) 组成。b) 成像系统的两个基本操作是将衍射花样或图像投影到荧光屏上。c) 通过调整中间镜的透镜电流，使中间镜的物平面与物镜的背焦面重合，可在荧光屏上得到衍射花样。d) 若使中间镜的物平面与物镜的像平面重合则得到显微像。4 图像观察与记录系统 该系统由荧光屏、照相机、数据显示等组成在分析电镜中，还有探测器和电子能量分析等附件，见图 1.6。图 1.5 透射电镜成像系统的两种基本操作：（a）将衍射谱投影到荧光屏；（b）将显微像投影到荧光屏图 1.6 透射电镜图像观察与记录系统示意图1.1.2真空系统真空系统由机械泵、油扩散泵、换向阀门、真空测量
42、仪泵及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至少要在 10-3 pa 以上。如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。 1.1.3供电控制系统加速电压和透镜磁电流不稳定将会产生严重的色差及降低电镜的分辨本领，所以加速电压和透镜电流的稳定度是衡量电镜性能好坏的一个重要标准。透射电镜的电路主要由高压直流电源、透镜励磁电源、偏转器线圈电源、电子枪灯丝加热电源，以及真空系统控制电路、真空泵电源、照相驱动装置及自动曝光电路等部分组成。另外，许多高性能的电镜上还装备有扫描附件、能谱议、电子能量损
43、失谱等仪器。它 的 光 路 与 光 学 显 微 镜 相 仿 ， 可 以 直 接 获 得 一 个 样 本 的 投 影 。 通 过 改 变 物 镜 的透 镜 系 统 人 们 可 以 直 接 放 大 物 镜 的 焦 点 的 像 。 由 此 人 们 可 以 获 得 电 子 衍 射 像 。 使 用这 个 像 可 以 分 析 样 本 的 晶 体 结 构 。 在 这 种 电 子 显 微 镜 中 ， 图 像 细 节 的 对 比 度 是 由 样 品的 原 子 对 电 子 束 的 散 射 形 成 的 。 由 于 电 子 需 要 穿 过 样 本 ， 因 此 样 本 必 须 非 常 薄 。 组 成样 本 的 原 子
44、的 原 子 量 、 加 速 电 子 的 电 压 和 所 希 望 获 得 的 分 辨 率 决 定 样 本 的 厚 度 。 样 本的 厚 度 可 以 从 数 纳 米 到 数 微 米 不 等 。 原 子 量 越 高 、 电 压 越 低 ， 样 本 就 必 须 越 薄 。 样 品 较薄 或 密 度 较 低 的 部 分 ， 电 子 束 散 射 较 少 ， 这 样 就 有 较 多 的 电 子 通 过 物 镜 光 栏 ， 参 与 成 像 ，在 图 像 中 显 得 较 亮 。 反 之 ， 样 品 中 较 厚 或 较 密 的 部 分 ， 在 图 像 中 则 显 得 较 暗 。 如 果 样 品太 厚 或 过 密
45、， 则 像 的 对 比 度 就 会 恶 化 ， 甚 至 会 因 吸 收 电 子 束 的 能 量 而 被 损 伤 或 破 坏 。 透 射 式 电 子 显 微 镜 镜 筒 的 顶 部 是 电 子 枪 ， 电 子 由 钨 丝 热 阴 极 发 射 出 、 通 过 第 一 ，第 二 两 个 聚 光 镜 使 电 子 束 聚 焦 。 电 子 束 通 过 样 品 后 由 物 镜 成 像 于 中 间 镜 上 ， 再 通 过 中间 镜 和 投 影 镜 逐 级 放 大 ， 成 像 于 荧 光 屏 或 照 相 干 版 上 。 中 间 镜 主 要 通 过 对 励 磁 电 流 的 调节 ， 放 大 倍 数 可 从 几 十
46、 倍 连 续 地 变 化 到 几 十 万 倍 ； 改 变 中 间 镜 的 焦 距 ， 即 可 在 同 一 样品 的 微 小 部 位 上 得 到 电 子 显 微 像 和 电 子 衍 射 图 像 。 为 了 能 研 究 较 厚 的 金 属 切 片 样 品 ， 法国 杜 洛 斯 电 子 光 学 实 验 室 研 制 出 加 速 电 压 为 3500 千 伏 的 超 高 压 电 子 显 微 镜 。 在能量过滤透过式电子显微镜（Energy Filtered Transmission Electron Microscopy，EFTEM ）中人们测量电子通过样本时的速度改变。由此可以推测出样本的化学组成，比
47、如化 学 元 素 在样本内的分布。关于衍射的原理，简单的引入惠更斯菲涅尔原理（ 1） 惠 更 斯 原 理惠 更 斯 指 出 ， 由 光 源 发 出 的 光 波 ， 在 同 一 时 刻 t 时 它 所 达 到 的 各 点 的 集 合 所 构 成的 面 ， 叫 做 此 时 刻 的 波 阵 面 （ 又 称 为 波 前 ） ， 在 同 一 波 阵 面 上 各 点 的 相 位 都 相 同 ， 且 波阵 面 上 的 各 点 又 都 作 为 新 的 波 源 向 外 发 射 子 波 ，子 波 相 遇 时 可 以 互 相 叠 加 ， 历 时 t 后 ， 这 些子 波 的 包 络 面 就 是 t+ t 时 刻 的
48、 新 的 波 阵面 。 波 的 传 播 方 向 与 波 阵 面 垂 直 ， 波 阵 面 是 一个 平 面 的 波 叫 做 平 面 波 ， 其 传 播 方 向 与 此 平面 垂 直 ， 波 阵 面 是 一 个 球 面 （ 或 球 面 的 一部 分 ） 的 波 叫 做 球 面 波 ， 其 传 播 方 向 为 沿 球 面 的 半 径 方 向 ,如 图 2-1-33（ 2） 菲 涅 耳 对 惠 更 斯 原 理 的 改 进 （ 惠 菲 原 理 ）波 面 S 上 每 个 面 积 单 元 都 可 看 作 新 的 波 源 ， 它 们 均 发 出 次 波 ， 波 面 前 方 空 间 某ds一 点 P 的 振 动
49、 可 以 由 S 面 上 所 有 面 积 所 发 出 的 次 波 在 该 点 迭 加 后 的 合 振 幅 来 表 示 。面 积 元 ds 所 发 出 各 次 波 的 振 幅 和 位 相 符 合 下 列 四 个 假 设 ： 在 波 动 理 论 中 ， 波 面 是一 个 等 位 相 面 ， 因 而 可 以 认 为 面 上 名 点 所 发 出 的 所 有 次 波 都 有 相 同 的 初 位 相 （ 可 令ds） 。0 次 波 在 P 点 处 的 振 幅 与 r 成 反 比 。 从 面 积 元 所 发 出 的 次 波 的 振 幅 正 比 于 的 面dsds积 ， 且 与 倾 角 有 关 ， 其 中 为 ds 的 法 线 N 与 ds 到P 点 的 连 线 r 之 间 的 夹 角 ， 即 从 ds 发 出 的 次 波 到 达 P 点时 的 振 幅 随 的 增 大 而 减 小 （ 倾 斜 因 数 ） 。 次 波 在 P 点 处 的 位 相 ， 由 光 程
