1、如何防止 PCR 形成引物二聚体？在 PCR 后的电泳带形成很宽很亮的带，对照 marker 时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR 时模板 DNA 浓度一般是多少最合适？答：1 这条亮带如果在 100bp 一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。PCR 模板大约在 104-106 个拷贝。答 2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释 10 倍或
2、是减少循环数。答 3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题； PCR 后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；3. Taq 酶，引物， Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；4. 取你所要加的上下游引物混合后，在 100 摄氏度下的沸水中煮 5 分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；5. 所配 MIX 中加 5%的甘油或者 5%的 DMSO，可以增强特异性；6. PCR 反应体系的配制在冰上进行，最后加 TAq 酶，PCR 结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认
3、为室温下有些 Taq 酶会将多余的引物合成为二聚体。7. 增加循环数可以适当降低引物二聚体；8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些） ；9. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l 没有区别，则考虑 Buffer 等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的 pcr 产物作模板二次 pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释 1001000 倍，如果间隔较长可以稀释50
4、100 倍。PCR 假阴性的原因分析PCR 的假阳性问题是在 PCR 诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但 PCR 的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了 PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成 PCR 假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：1.PCR 仪本身的质量问题。 PCR 仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如
5、非特异性扩增（假阳性） 、扩增效率下降(假阴性）等问题.2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在 PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象 PCR 那样明显影响检测结果罢了。离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效
6、半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。3.试剂开壳剂和操作问题造成标本 DNA 没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。问题 1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer 对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量2.更换 Buffer 或调整浓度3.重新设计引物（避
7、免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题 2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式 PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题 3：拖尾现象：产物在凝胶上呈 Smear 状态。原因：1.模板不纯2.Buffer 不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+ 浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2
8、.更换 Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低 dNTP 和镁离子的浓度6.减少循环次数问题 4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存请问 PCR 引物存放时间是多少？这要看是什么状态，要是粉末的话，在20 度可以存放好几年；要是已经把引物稀释成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的时间，甚至更长。不过这也要看你们实验室的冰
9、箱是不是经常开启，要是是的话，存放时间就很受影响，实验室的冰箱就是经常打开，而且有时候大家找东西要找好长时间，所以引物总是用半个多月的时间，效力就下降了，PCR 后的条带明显就没有以前亮了。建议你合成引物的时候，让公司每个 OD 分装成一管，每次你用的时候，取一管稀释成使用浓度；或者先稀释到储存浓度，分装后要用的时候再稀释到使用浓度。另外一定要注意避免反复冻融，反复冻融会使存放时间变短的。最简单的就是分装了,以储存浓度保存,稀释 10 或 20 微升,就可以用好些次,即可避免反复冻融还可以避免整管引物都被污染.干粉20 度可以保存一年，稀释后20 度可以保存半年。可以先稀释成 100uM，分装
10、成几管。然后再稀释成 50uM 和 20uM 的。每次用 20uM的做 PCR 即可。尽量避免反复冻融。稀释用的水 PH 值要求大于 7（TE 比灭菌去离子水好） ，并且无菌。真空干燥的 DNA 呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失.稀释方法：1 OD260 引物干粉约为 33 微克；碱基的平均分子量为 324.5；引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量举例：一管标明为 2 OD 的 20 碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66g摩尔数=66 / 6490 =0.010 mol= 10 nmol
11、若您需要溶解为 10M(=10pmol/l)的溶液，只需加 10/=10pmol/ul,=1mlddH2O 充分溶解即可。如何提高 PCR 反应的特异性引物引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于 24 核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 -生物秀实验频道Mg2+较高的 Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确
12、定最佳浓度，从 1mM到 3mM，以 0.5mM 递增，进行最适 Mg2+浓度测定退火温度Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的 Tm 低 5的温度。合理的退火温度为 55-70。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合 -生物秀实验频道 巢式 PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式 PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高 PCR 反应的特异性和灵敏度递减 PCR通过在 PCR 的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm高大约 5的退火温度
13、下开始，然后每个循环降低 1到 2，直到退火温度低于 Tm 5。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势热启动 PCR通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动 DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95 加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了 PCR 反应的灵敏度及特异性。热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一PCR 增强剂包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过
14、二级结构区。PCR 扩增过程中常见的问题及解决方法PCR 技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展 PCR 研究用应用工作。 PCR 技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟 PCR 技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在 PCR 技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展 PCR 工作，更好地发挥 PCR 技术的工具作用，我们根据多年来 PCR 工作总结的经验，对 PCR
15、扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。一、 假阳性扩增在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手： 试剂污染：厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于 PCR 仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水） ，便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 实验室污染：这是最常见的污染源，由于 PCR 技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍
16、以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法：实验室污染是 PCR 扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严
17、格地分开，不可互换。PCR 室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 采样污染：在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR 扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量 DNA，这些痕量 DNA 便成为PCR 模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。二、 假
18、阴性扩增：如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因： 仪器故障：出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴性其它原因的基础，仪器运转是否正常是 PCR 扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR 扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 试剂失效或无效：了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了
19、解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释 1000 倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。 试剂的敏感度：有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：试剂质量不过关； 操作方法不规范； 主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重
20、提一下：目前经常碰到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用抽象的阳性率应该是 60或 20这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR 结果” ，这是因为 “二对半”与“PCR” 是两种完全不同的检测方法，其检测结果的意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试剂，国内的“二对半” 试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在 50以下，怎么可能作为质量评
21、定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如 HBV 全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按 1：10、1：100、1：1000、1：10000 如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释 10000 倍以上，结核菌每毫升中在 100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其
22、它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。三、 扩增产物拖尾有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear 现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关： 扩增系统不完善：这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP 浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。 模板处理方法不完善：PCR 扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对 PCR主要成分之一 DNA 聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样
23、作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。 引物设计不合理：引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由 15-30 个 BP 组成；其次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC 碱基含量应在 45-55左右；第四，两个引物在 3未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的
24、引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般 PCR 扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在 320nm 的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在 0.1-0.5mM，一般经 30 个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条 20BP 左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的 DNA 序
25、列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的 DNA 序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体
26、的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。PCR 基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR 是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对 PCR 的深入研究，在 PCR 的应用过程中不断总结经验， PCR 这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。PCR 产物的电泳检
27、测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有 模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质， 模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白， 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时
28、使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分
29、装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+ 浓度：Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短
30、，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，
31、容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一
32、致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93 变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，d
33、NTP 浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆 PCR 产物1)克隆 PCR 产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X 连接液, 50ng 质粒 DNA,1Weiss 单位的 T4 连接酶，插入片段共 10ul。室温保温 1 小时，或 4过夜。在这 2 种温度下，缺 T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温 1 小时能满足大多数克隆
34、要求，为提高连接效率，需 4过夜。2)PCR 产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将 1ug/ul 质粒 1:100 稀释,1ul 用于 100ul 感受态细胞转化。用 SOC 稀释到1000ul
35、后，用 100ul 铺板。培养过夜，产生 1000 个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板 DNA 的总量。铺板 DNA 的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用 10ng DNA，用SOC 稀释到 1000u 后含 10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用 1 ng DNA。转化率为：1000 克隆 X10（3 次方） ng /铺板 1 ng DNA ug=10（ 6 次方）cfu/ ug转化 pGEM-T 应用 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用 pGEM-T 正对照，或 PCR 产物，产生20-40 蓝斑（用
36、指定步骤 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞） ，表明载体失去 T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA 连接酶（M1801，M1804，M1794 ）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA 连接酶替换。D）用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体，连接 pGEM-T 正对照，转化高频率感受态细胞（10（8 次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%应为白斑，如产生20-40 蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为
37、提高效率，需 4过夜。B）插入片段带有污染，使 3-T 缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体 3-T 缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受 UV 过度照射，时有发生。UV 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA 必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热 DNA 聚合酶的扩增产物末端无 A，后者是 pGEM-T 或pGEM-T Easy 载体克隆所需。加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端
38、加 A。详情查 pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料（TM042） 。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系：10扩增缓冲液 10ul4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L引物 各 10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是
39、PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基： G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补
40、，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。做配药品，稀释引物，PCR 实验中，对水的要求要很高么?配制一般化学试剂使用二级水即
41、可。配制生化试剂，包括引物稀释、PCR 所用水，以及转膜、核酸抽提等，必须使用二次蒸馏水或一级水。 1 PCR 引物设计的原则引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配) 。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length） ，产物长度（product length） ，序列 Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用G 值反映) ，形成引物二聚体(
42、primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition） ，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应 2。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导
43、致错配。引物 3端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加2。3. 引物 3端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3端使用碱基 A34。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。5端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物 2。4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大25 。5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在
44、72左右可使复性条件最佳。 Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm4(G+C)2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 67。6. G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3端 G 值较低（绝对值不超过 9） ，而 5端和中间G值相对较高的引物。引物的 3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应6。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行8 。
45、8. 对引物的修饰一般是在 5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。2 扩增较大片段 DNA 的 PCR 方法一般 PCR 方法在扩增大片段 DNA 时的局限性：通常所用的 PCR 方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA 聚合酶，具有完整
46、的 3外切酶校读活性（3-editing-exonuclease） ，可以将每个循环中碱基的错配率由 10*-4 降到 10*-3，从而提高 PCR 产物的准确性。但它在扩增 1.5-2.0kb 片段时，效率比 Klentaq l(Taq DNA 聚酶 N-末端缺失突变体，类似于 E.coli DNA 聚合酶 I Klenow 片段）或 AmpliTaq（全长的 Taq DNA 聚合酶）等聚合酶差；在扩增 5.0-7.0kb 片段时亦不比各种形式的 Taq DNA 聚合酶（如 Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5 等 N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的 PC
47、R 反应产物限制在 5.0kb 以内。超出这一范围，PCR 扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为 30 分钟（10 倍于通常所需）亦无改进。利用两种 DNA 聚合酶进行较大片段 DNA 的扩增美国华盛顿大学医学院的 Barnes WM 等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR 反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA 聚合酶虽然可以通过“校读” 功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将 Pfu DNA 聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用 Klentaq l 等 D
48、NA 聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使 Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按 15:1 的比例混合使用 Klentaq l 和 Pfu DNA 聚合酶，引物大小为 27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。控制脱嘌呤反应增强扩增效率在 PCR 反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA 聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板 DNA 在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl 和 Nyberg 的研究结果显示：在 70 pH7.4 的条件下， 单链DNA 脱
49、嘌 呤反应的速度是双链 DNA 的 4 倍；100 pH7.0 时，100kb 的碱基中每分钟将有 1 个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高 1，pKa 值降低0.03。因而，在 25时 pH8.55 的 PCR 反应体系，到 95热变性时，pH 值将变为 6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。 为了解决这一问题，可以采取下列措施：缩短热变性时间，Barnes 等在扩增 35kb 的大片段时，变性条件为 955 秒，取得满意结果；尽可能使升温、 降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；适当提高反应体系的 pH 值，反应最初应控制在 pH8.8-9.2 范围；适当增加延伸时间（可长至 20 分钟） 。使用这种方法可以扩增最大为 35kb 的 DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的 DNA 分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。酶及其浓度
