1、华中科技大学硕士学位论文nanoparticles targeting stathmin gene was prepared successfully;GFPfluorescence expression of the reporter gene was detected in A549 cellstransfected by nanoparticles;After transfected by nanoparticles, flowcytometry showed there was a G2 /M phase arrest in transfected cells(P 85%）购自青岛海汇
2、生物工程有限公司；DNA Taq酶购自日本Toyobo公司；逆转录试剂盒购自立陶宛 Fermentas公司 Taq Polymerase、胰蛋白酶、琼脂糖购自美国 Amresco公司；T4连接酶购自美国 Promega公司；PI染液购自美国 Sigma公司；凝胶 DNA提取试剂盒 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0购自日本 TaKaRa公司；兔抗人 Statnmin- IgG（1 ：1000）、羊抗兔 IgG（1：10000）购自英国 Abcam公司；脂质体 Lipofectamine TM 2000、Trizol（100ml/ 瓶装）购自美国 In
3、vitrogen公司；肺腺癌细胞株 A549由武汉协和医院肿瘤中心保存；质粒 pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛公司: 质粒基因结构见图 1.图 2质粒 pGPU6/GFP/Neo，siRNA真核表达载体。该质粒长度 5117bp。其主要组成：多克隆位点依次包含 Bbs I、Pst I、BamH I三个酶切位点，定位位置标注如图；多克隆位点上游通过 hU6启动子启动靶序列 shRNA的表达；SV40启动子控制表达的卡那霉素抗性基因；标记报告基因 GFP。9华中科技大学硕士学位论文2.主要溶液的配制2.1 RPMI1640培养基配制RPMI1640粉剂，Hepes 2 g，NaHCO3 3.
4、5 g，加三蒸水定容至 2000 ml溶解，调 PH值为 7.0，过滤除菌，分装置 4保存。2.2 0.25%胰酶配制0.5 mg胰酶，加 PBS至 200 ml溶解，调 PH值至 7.4，4放置 2-3 h，用孔径为 0.22 um滤器过滤除菌，分装保存于 4C。2.3 0.15mol/L PBS缓冲液（ PH 7.2-7.4）配制NaClKClNa2HPO4.12H2OKH2PO48.0g0.2g1.15g0.2g双蒸水至 900ml溶解，pH值调至 7.2-7.4，定容成 1000 ml，高压灭菌。2.4 TE缓冲液（TE Buffer）配制方法1M Tris-HCl Buffer（PH
5、 8.0）0.5M EDTA（PH 8.0）5ml1ml加入 400 ml双蒸水均匀混合后，再将溶液定容到 500ml。高温高压灭菌，室温保存.2.5 LB培养基配制胰蛋白胨酵母提取物NaCl10g5g10.0g加入 950ml双蒸水，摇晃溶解后，用 5M NaOH调 pH值至 7.0，双蒸水定容至1000 ml，高压（1.034105 Pa）蒸汽灭菌 20min，4C保存2.6 LB琼脂平板培养基配制胰蛋白胨酵母提取物NaCl琼脂粉10g5g10.0g15g10华中科技大学硕士学位论文溶解于 900 ml水，用 NaOH调节 pH至 7.4后，定容至 1L，1.034X105 Pa，120高
6、压灭菌 20 min，在无菌操作台中铺 LB琼脂平板 (20ml培养基/板)，铺板前液体中加入卡那霉素，使卡那霉素终浓度达到 50ug/ml，铺板后 37放置 30 min，封口后于 4冰箱保存。2.7 MTT染液MTT粉 250 mg溶于 PBS 50 ml，磁力搅拌 30分钟使粉末充分溶解， 0.22m微孔过滤除菌，分装，避光 4C保存，2周内有效。2.8壳聚糖纯化：高效液相色谱法分离纯化得到分子量 50 kDa、 150 kDa、 300kDa的纯化壳聚糖，产品干燥后 4C保存。2.9 0.03%壳聚糖溶液配制取壳聚糖 30mg加入到三蒸水 80ml，用冰醋酸调定 pH值约为 5，水浴箱
7、 30-40C左右温育，振荡。溶解后，调定 pH为 5.0，定容至 100ml。0.22 m微孔过滤除菌，分装后 4C避光保存。3.主要仪器设备紫外分光光度计 UV-765型为上海精密科学仪器有限公司产品；超净工作台 JW-CJ-1F为苏州净化设备厂生产；光学显微镜、倒置荧光显微镜为日本 Olympus公司产品CO2培养箱为美国 Forma Scientific公司产品；台式高速离心机、高速低温离心机德国 Eppendoff公司产品；HHW-2恒温水浴箱由西安明克斯检测设备有限公司生产；紫外荧光摄像装置 ReProstar3为瑞士 CAMAG公司；电子天平 BL一 2000s是美国 Setra
8、公司的产品ECL plus Western Blotting Detection System为 Amersham公司生产；PCR仪(MJ Research Peltier Thermal Cycler( PTC - 200),德国。11华中科技大学硕士学位论文实验方法1.构建靶向 stathmin基因的 shRNA真核表达质粒：1.1 shRNA 模板设计：shRNA 模板采用 T6 结构作为终止序列，并以 TTCAAGAGA为 loop。在 stathmin基因（序列号：NM_203399）序列 CDs区筛选 2个以 AA引导的序列作为作为靶序列，靶位长度均为 21nt。同时，正义链 5端
9、添加 CACC作为 BbsI酶切互补端，而反义链连接 GATC作为 BamH I酶切互补端。序列送交化学合成 shDNA模块。ShSTA-1：靶位5-GCACGAGAAAGAAGTGCTTCA-3；3-CGTGCTCTTTCTTCACGAAGT-5；正义链 5-CACC GCACGAGAAAGAAGTGCTTCA TTCAAGAGA AAGCACTTCTTTCTCGTGC TTTTTTG-3；反义链：5-GATCCAAAAAA GCACGAGAAAGAAGTGCTTCA TCTCTTGAA TGAAGCACTTCTTTCTCGTGC -3。shSTA-2：靶位5-GGATAAGCACATTGA
10、AGAAGT-3；3-CCTATTCGTGTAACTTCTTCA-5；正义链 5-CACCGGATAAGCACATTGAAGAAGTTTCAAGAGAACTTCTTCAATGTGCTTATCCTTTTTTG-3；反义链:5-GATCCAAAAAAGGATAAGCACATTGAAGAAGTTCTCTTGAAACTTCTTCAATGTGCTTATCC-3。阴性对照质粒模块：正义链 5- CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT CAAGAGATT ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTTG-3；反义链 5- GATC CAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGT AA
11、TCTCTTG ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3。1.2 shDNA退火：合成的模块 shDNA用 TE溶解成 100uM的溶液，配置退火体系如下12华中科技大学硕士学位论文试剂10 shDNA退火缓冲液正义链 (100 uM)反义链 (100 uM)双蒸水Total体积(ul)5553550然后再 PCR仪上按以下程序进行退火：95C 5min; 85C 5min; 75C 5min; 70C5min; 4C 保存。产物即为浓度 10M的 shRNA模板。1.3质粒载体酶切：将模板溶液稀释成终浓度 20 nM。载体质粒 pGPU6/GFP/Neo用 Bbs I、BamH I内切酶
12、，37C 50l体系酶切 1小时，体系如下：试剂10缓冲液 GBamH IBbs IpGPU6/GFP/Neo双蒸水加入量5 ul2 ul2 ul2 ug定容到 50 ul酶切产物琼脂糖电泳，使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 (TaKaRa)按照说明书步骤回收，得到纯化的线性载体质粒。1.4连接载体和 shDNA在含 T4连接酶的 20l的反应体系中 22C 1小时反应连接，得到 pU6/GFP/Neo-shRNA-Stathmin（分别命名 shSTA-1,shSTA-2）反应体系如下：试剂10 T4连接酶缓冲液pGPU6/GFP/Neo(
13、双酶切产物)shRNA template( 20nM)T4 DNA ligase双蒸水总体积1.5大肠杆菌电转化感受态细胞制备13体积（ul）21111520华中科技大学硕士学位论文将菌株置 LB培养基上，37C下过夜培养；准备高温灭菌大的离心瓶（250ml）；准备无菌双蒸水（大约 2升），冰箱保存预冷；第二天，取 0.2-1 ml过夜培养物至装有 500 ml LB的 1-2升摇瓶中；37C下剧烈振荡培养 4-5小时；从摇床中取出摇瓶，冰上冷却 20分钟；细胞 4C 5000 g离心 15分钟，弃上清液；预制冷的灭菌冰水重悬浮细胞。先用加样枪于少量体积中（3毫升）重悬细胞，然后加水稀释至离心
14、管的 2/3体积；照上面步骤重复离心，小心弃去上清液；同法，用灭菌的冰水重悬细胞；离心，弃上清液；用 20ml灭菌的、冰冷后的 10%甘油重悬细胞；同前法步骤离心，小心弃去上清液；用 10%甘油重悬细胞至最终体积为 2-3ml；将感受态细胞悬液分装，于-80C保存。1.6重组质粒转化细菌：取 T4连接酶体系中的质粒产物，转化感受态 Ecoli细菌:吸取感受态细胞悬液 200ul到无菌离心管中，加入质粒 DNA（小于 10 ul的体积，DNA 小于 50 ng），轻轻摇晃混匀，冰上放置 30min。将离心管放入预热至 42的循环水浴中 90 s，不要摇动离心管。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷
15、却 1-2min。向其中加入 800 ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37，然后将离心管转移至摇床，低于 50转/分摇晃温育 45min，使细菌复苏并表达质粒标记的抗生素抗性基因。将 200 ul已转化的感受态细胞转移到 50 ug/ml Kanamycin的 90mm平板的 LB培养基中，将菌液均匀划开。平板正向放置于室温下，直至液体被吸收。倒置平皿，于 37培养，12-16h后可出现菌落。挑选细菌单克隆集落，用 50 ug/mlKanamycin的 LB液体培养基于摇床摇菌（37 C，200rpm，12-14小时），扩大培养并用 10%甘油的 LB培养基保种。1.7提取质粒按照质粒
16、小提试剂盒（北京 Tiangene公司）操作说明进行。1.8获取的质粒产物，用 Bbs I、 BamH I内切酶在 37 C 60l体系酶切 1小时（体系同前），酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.9基因测序，鉴定重组质粒靶序列的正确性。2.脂质体介导干扰质粒转染验证干扰质粒功能2.1细胞复苏、培养及细胞传代超净工作台消毒，并准备细胞培养相关器械、试剂备用。预备温水（37C水浴箱中保温）用大烧杯盛放用于化冻。查对保种记录编号。迅速开启液氮罐取14华中科技大学硕士学位论文出 A549细胞冻存管，立即丢入烧杯温水中，快速摇晃，使冻存管中的冻存液迅速化冻，约 2-3min后，离心机 800g-1000g
17、，离心 5分钟。超净工作台中开盖，弃上清，加入含 10%新生牛血清的 DMEM培养基 1ml，重悬细胞。将肺腺癌细胞株A549以含 10%新生牛血清 RPMI 1640（Gibeco ）的 RPMI 1640培养基培养 4ml-5ml于 25cm2培养瓶，并置于 5%CO2的 37C培养箱。待细胞贴壁生长至 80%-90%融合时，传代：弃去细胞培养瓶中原有培养基，向瓶内加入 PBS平衡盐溶液（pH7.2）3ml，轻柔洗涤两次后，弃液，加入 0.25%胰蛋白酶消化液 1ml室温消化 2-5分钟，镜下观察细胞收缩稍变圆时，即弃去消化液，加含血清培养基约3ml终止消化，无菌玻璃吸管反复均匀吹打，使贴
18、壁细胞完全脱落且不成团。将吹打均匀的细胞悬液 0.5-1.0 ml均匀传至每个细胞培养瓶中，并加含 10%新生牛血清 1640培养基 4ml，轻轻振荡均匀，转至细胞培养箱静置贴壁培养。2.2转染细胞按照 1*106个/孔的密度均匀接种于六孔板，备 24小时后转染。将细胞用 PBS轻柔洗涤 2次，弃液，加入无血清 1640培养基 2ml/孔。取质粒 DNA 2g（每孔转染所需的 DNA量）及 Lipofectamine 2000 5l分别各对应 125l无血清 1640比例稀释，温育 5分钟后二者混合，再温育 20分钟，得到 DNA-脂质体复合物。将 DNA-脂质体复合物溶液按 250l/孔均匀
19、加入培养板，轻轻摇匀之后返至培养箱培养，4小时后更换成 10%新生牛血清 1640培养基继续培养。24-48小时后用于检测和处理。2.3 RT-PCR检测 stathmin基因 mRNA表达2.3.1总 RNA提取：用 Trizol法提取细胞总 RNA,逆转录得到 cDNA，方法步骤如下:(1)细胞裂解均质化：待细胞在六孔板中生长覆盖 80%-90%时，可用于 RNA提取。准备加样枪头等物品，无水乙醇、DEPC处理水、异丙醇、氯仿等 4C冰箱中预冷。开 2-8C低温高速离心机预制冷数分钟。关灯避光，4 C取出 Trizol裂解液，备用。取制冷冰袋，将细胞培养板置于冰袋上。吸弃培养基后，每孔在加
20、入 1mlTrizol裂解液后，立即吹打板底细胞层，直至液体由粘稠变得清稀为止。如此般将六孔板置于冰上逐孔处理。将细胞匀浆裂解液体转至 RNase Free的 Ep管中，（若暂不处理，短期内保存于-20C）。15华中科技大学硕士学位论文（2）水相/有机相分离：均质化的样本在室温下温育 5min，（15-30 C），温育后，每管 1ml Trizol对应地加入 200l氯仿，立即剧烈振荡摇晃 15 sec，温育 3min（室温 15-30C）。高速低温离心机 4C，12000g，离心 10min。（3） RNA的沉淀：样本离心后，相分层（有机相/水相），小心的吸取上层水相（约 400l）转入另一
21、 Ep管。在水相中加入异丙醇 0.5 ml。室温 15-30C下温育 10分钟，高速低温离心机 4C，12000 g，离心 10min。（4） RNA的洗涤：离心后，可见 Ep管底白色凝胶状沉淀，吸弃上清。用 DEPC水与无水乙醇配置成浓度 75 %的溶液，每 Ep管加入 1 ml，轻轻摇晃弹动管底后，高速低温离心机 4C，7600 g，离心 5min。（5） RNA溶解：离心后，弃液，小心吸干管内残余液体。开盖敞口于空气中，干燥约 5 min，直至不见明显水滴。将 RNA溶于 10l的 DEPC处理水，轻轻抽吸数次使其充分溶解。室温温育 10分钟，取 RNA溶液 1l，加入到 99l的ddH
22、2O中配成 1：100稀释液。紫外分光光度计测定 RNA浓度。2.3.2逆转录（1）RNA总变性：按下面的体系加入试剂：试剂总 RNAOligo dTRnase抑制剂DEPC处理水Total加入量（ug或 ul）5g1l1l补至总体积 13l13 ul混匀后，72 C总变性 5min，再返至冰上冷却 5min。（2）逆转录：向已被总变性的溶液体系中依次加入下列试剂：试剂总变性后混合溶液体系5Buffer10 mM dNTP逆转录酶Total16加入量（ug或ul）13 ul4 ul2 ul1 ul20 ul华中科技大学硕士学位论文混匀后短暂点动离心。Ep管置于 PCR仪上，设置 42C， 60
23、 min，反应延伸，95C 5min，灭活，终止反应。返至冰上冷却 5min。即得到 cDNA。产物 cDNA即可用于 PCR扩增，或-20 C保存备用。2.3.3 PCR扩增引物序列均利用软件 Oligo6.0设计：Stathmin引物（ 326bp）：上游引物 5GAAAGAACTGGAGAAGCGTG 3；下游引物 5 CCATTTGTGCCTCTCGGT 3。内参 GAPDH引物（630bp）：上游引物 5 CTGGCGCTGAGTACGTCGTG 3；下游引物 5CAGCCCCAGCGTCAAAGGT 3。94 C预变性 4 min，94C 30 sec，57C 30 sec，72C
24、 30 sec，共 26次循环，72C延伸 5分钟。反应体系如下：试剂2PCR Buffer(含 MgCl2)10 mM dNTP上游引物下游引物cDNATaq酶双蒸水总体积体积（ul）12.50.51121725 ul（4）琼脂糖凝胶电泳:PCR产物取 2ul，于 2%琼脂糖凝胶电泳，条带分析软件Bandscan 5.0分析条带灰度。（5）根据 PCR检测结果，从两个质粒中筛选沉默效率较高的质粒作为工具进行后续的研究 (特别标注：结果显示 shSTA-2沉默效率高，选择 shSTA-2作后续研究 )。2.4 Western Blot检测 stathmin蛋白表达（1）提取总蛋白：取培养 A5
25、49的 6孔板，弃尽培养液，每孔加入 100微升裂解液（含 PMSF）的比例加入裂解液，冰上裂解 30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。充分裂解后，10000-14000g离心 3-5分钟，取上清，分装于0.5ml离心管（20短期保存）。17华中科技大学硕士学位论文（2）细胞裂解匀浆液，离心(12000转，15min，4)后，取上清；取部分样品用酶联仪检测蛋白含量(BAC法)；样品中加入 5上样缓冲液后取 20mg蛋白用8%SDS-PAGE进行电泳； 100V恒压将蛋白转至醋酸纤维膜，转膜时间 60min后，室温下将膜在 5%奶粉/0.01 mol/L PBS中封闭 1-2h;用兔
26、抗人 Statnmin- IgG (1：1000，以 5%奶粉/0.01mol/L PBS，下同) 或鼠抗人 b-acting单克隆抗体(1:1,000,Sigma)室温孵育 1-2h；5%牛奶，PBS 漂洗 3次，每次 10min；过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG (1:5,000)室温 1h;内参羊抗鼠 IgG (1:5,000) 0.01mol/L PBS漂洗 3次，每次 10min;（3）化学发光试剂(ECL plus Western Blotting Detection System, Amersham)反应 5min；将 X光片放在醋酸纤维膜上曝光 5-15min,冲洗胶片。（4）用
27、 Bandscan 5.0条带分析软件分析条带辉度比值。3.壳聚糖纳米载基因颗粒介导干扰质粒的转染3.1构建壳聚糖纳米载基因颗粒（复凝聚法，方法如下）每孔用量按以下比例（即 N/P = 5）配置:溶液 A：质粒 DNA取 10g溶于 10 mM Na2SO4配置成 90.9l；溶液 B： 0.03%壳聚糖（50kDa，pH为 5.0）80.6 l；溶液 A、B同时置于 55C水浴箱温育 20分钟；涡轮振荡的条件下，迅速取溶液 B逐滴滴加到溶液 A中，继续振荡 30秒，返至 55C水浴温育 3分钟，即得到可用于转染的壳聚糖载基因纳米粒悬液。3.2壳聚糖纳米载基因颗粒转染准备细胞：接种 A549细
28、胞至六孔板，24h后，细胞生长至大约 70%-80%左右时，适宜于壳聚糖介导的基因转染。取接种好的细胞培养六孔板，吸弃原培养基， PBS 1-2ml轻柔洗涤细胞 2次；取调定好 pH值为 6.7-6.9之间的无血清 1640培养基，以 2ml/孔滴加到六孔板。取制备好的壳聚糖载基因纳米粒悬液 171.5 ul/孔（即含质粒 10g且N/P=5,）逐滴均匀铺加至到培养孔中，轻轻振摇均匀后返至 37C培养箱孵育8h，更换含常规含 10%新生牛血清的 1640培养基 2 ml/孔，继续培养。24-48 hours18华中科技大学硕士学位论文（根据检测需要而定）后可应用于相关处理和检测。4.细胞活力检
29、测 MTT法评估对紫杉醇的药物敏感性4.1脂质体介导 shSTA转染 A549细胞的 MTT检测4.1.1脂质体介导 shSTA转染 A549细胞，方法同上所述；4.1.2转染 24小时后，0.25%胰蛋白酶消化获取各组细胞（包括未处理组作对照），终止消化后，吸管吹打充分，是细胞分散成粘连少的单个细胞悬液；取单细胞悬液按照 104细胞/孔的密度接种于 96孔培养板；设计每组 3个复孔，设置 6个浓度梯度（0，0.2，1，5，25，125， ng/ml），并设置相应对照孔等；每孔培养基总量 200微升。37、5 CO2培养箱中培养 24 h；4.1.3待细胞贴壁后，即用含各浓度的紫杉醇的全培养基
30、作用细胞；4.1.4紫杉醇作用 48小时后，弃液，避光条件下，每孔加入 20微升 MTT溶液（5mg/ml），温箱中避光孵育 4小时；4.1.5小心吸弃液体，加入 DMSO液（150微升/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上小心振荡 10分钟，使结晶物充分溶解；4.1.6酶标仪在 570nm波长检测 OD值，计算各组细胞的半数抑制率 IC50。4.2壳聚糖介导 shSTA转染 A549细胞的 MTT检测壳聚糖介导 shSTA转染 A549细胞后，MTT检测处理方法相同，同法计算半数抑制率 IC50。19华中科技大学硕士学位论文结 果1.质粒鉴定1.1质粒酶切鉴定图 3质粒酶切的产物电泳 Marke
31、r为 Lambda DNA/Eco130I(Sty I)。1、2. shSTA-1经 Pst I酶切； 3、4. shSTA-2 经 Pst I酶切；5、6. shSTA-1经 BamH I酶切；7、8. shSTA-2经 BamH酶切。质粒 PstI酶切位点位于 Bbs I、BamH I之间。当载体线性化时被 Bbs I、BamH I酶切之后，去掉了含 PstI位点的片段，所以 PstI内切酶对阳性重组质粒不起作用。即如图 3所示，重组阳性质粒可以被 BamH I切开，却不能被 PstI酶切。所以该图提示重组质粒连接正确。1.2质粒基因测序鉴定图 4质粒基因测序：shSTA-1图 5质粒基因
32、测序：shSTA-2测序结果显示序列及构建无误，提示 shRNA表达质粒构建成功。20华中科技大学硕士学位论文2 RT-PCR检测 mRNA表达水平（脂质体介导转染）图 5 PCR凝胶电泳图（脂质体介导转染）：分组：1. shSTA-1组； 2. shSTA-2组； 3.阴性对照质粒组；4.未转染组；M，Marker，为 DNA Ladder2000。图 6 RT-PCR产物凝胶电泳条带灰度比值（图像灰度用 Bandscan5.0条带分析软件扫描）。2.1计算目的基因与内参基因条带灰度比值：未转染组 1.63，则阴性质粒组为21（华中科技大学硕士学位论文1.64，shSTA-1组为 1.19，
33、shSTA-2组为 0.88。2.2四组间灰度比值两两比较，显示阴性对照质粒组与未处理组无明显统计学差异，而两质粒转染组与未处理组均具备统计学差异，质粒转染组明显低于未转染组，且 shSTA-2明显低于 shSTA-1（P0.05）。（本实验后续研究选择以沉默效率较高的质粒 shSTA-2为工具）3. Western Blot检测蛋白质表达水平（脂质体介导转染）Western Blot检测干扰质粒 shSTA转染 A549细胞前后，蛋白质表达水平的改变，见图 7。图 7脂质体介导转染 A549细胞后 stathmin蛋白表达水平： 24小时、48小时、72小时）图 8 Western Blot
34、检测蛋白质表达水平22华中科技大学硕士学位论文Western Blot检测蛋白质水平的改变（见图 8），同 mRNA，提示转染干扰质粒后与未处理组相比蛋白质表达水平降低（P0.05），而阴性对照质粒转染组的表达无统计学差异，转染后连续 3天分别提取蛋白，24h组、48h组及 72h组三组检测结果无统计学差异（多组均数比较的单因素方差分析）。4.壳聚糖与脂质体介导干扰质粒转染的效果比较图 9分别用壳聚糖与脂质体介导转染 A549细胞株 24hours后荧光质粒为含 GFP报告基因的阴性质粒；左：壳聚糖介导转染后的细胞及对应的荧光照片；右：脂质体介导转染后的细胞及对应的荧光照片。4.1形态学学改变
35、，如图 9显示，壳聚糖介导基因转染后细胞外表形态未见明显皱缩变形，而脂质体介导阴性质粒转染后，出现明显的细胞皱缩变圆明显，大范围脱离瓶底而漂浮。4.2壳聚糖纳米载基因颗粒转染 A549细胞，出现了明显的荧光表达，壳聚糖纳米载基因颗粒转染组荧光表达率为（6.353.26）%。4.3壳聚糖转染组与脂质体转染组细胞荧光表达率的比较，见图 10采用 t检23华中科技大学硕士学位论文验对两独立样本的均数进行比较，两组转染效率具有显著性差异，壳聚糖介导转染组细胞转染率低于脂质体组，具有统计学意义（P0.05）。图 10镜下人工计数法计算报告基因 GFP荧光表达率5. MTT检测结果以 shRNA-stat
36、hmin质粒为工具，多次 MTT试验得到未转染组，壳聚糖介导转染组以及脂质体介导转染组的 3组 OD值，并计算 IC50，以其均数作比较。分析（软件： SPSS15.0）结果如下：24华中科技大学硕士学位论文图 11 MTT检测壳聚糖与脂质体分别介导 shSTA转染后的 IC50变化。5.1未转染组、壳聚糖介导转染组，脂质体导转染组的IC50：见下表分组未处理组壳聚糖组脂质体组IC50（ng/ml）52.682.4440.984.8416.363.315.2采用单因素方差分析，显示组间差异有统计学意义（P0.05）；5.3 SNK检验提示各组之间两两比较差异均有统计学意义。25华中科技大学硕士
37、学位论文讨 论实验选择了 stathmin这个基因作为研究的靶点，成功构建了构建 shRNA的真核表达质粒 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-stathmin（为了方便表述，简称 shSTA）。pGPU6/GFP/Neo是以 RNA聚合酶操纵的 U6启动子启动并以连续 4-5个 U作为终止信号的 RNA表达载体，这是一种精确且高效的 RNA表达系统28。我们用常规转染试剂脂质体介导转染 A549细胞，通过 PCR、Western Blot对 mRNA与蛋白质表达水平的检测，均证明该质粒在我们选择 stathmin基因序列中的靶位上有可观的沉默效率这也是基因研究领域 siRNA技术应用在效
38、能方面最具魅力的优势。本实验成功构建的质粒 shSTA对 stathmin的基因沉默效果高效而稳定，为后续研究以及推广应用提供了有效的基因工具。本实验以 tathmin作为治疗靶点，主要是由于它在肺癌病理环节中的重要作用以及它对肺癌化疗敏感性的影响。许多研究都表明 stathmin基因与多种肿瘤的化疗疗效相关。Nishio等人的研究发现，stathmin的过表达却能提高肺癌细胞系对 vindesine的敏感性31。本实验结果显示 stathmin表达抑制能提高肺腺癌对紫杉醇的化疗敏感性。由于Stathmin蛋白解聚微管的作用，所以在有丝分裂过程中表达增加时减少微管聚合而在早期抑制纺锤体形成；当
39、表达减少时，微管解聚不足而在后期抑制细胞分裂。表达增强与表达不足，对细胞有丝分裂的调节功能，都分别在不同的时相发挥作用。Mistry SJ等利用核酶封闭 stathmin基因表达，证实该基因的表达抑制能使细胞阻滞在 G2/M期，并能使恶性细胞发生逆转 20。提示 Stathmin基因的功能缺失对肿瘤的抑制是可以调控微管而在细胞周期调控上发挥作用的。但是，长春碱类与紫杉醇类药物与 stathmin蛋白相互作用的机制是否存在差异仍需进一步严格验证。利用壳聚糖纳米载基因颗粒，本实验通过控制制备及转染过程中一系列的参数，选择分子量 50kDa、高度纯化的壳聚糖以 N/P = 5的条件下构建纳米颗粒悬液
40、，并将培养基 pH控制在 6.7-6.9的无血清条件下（见实验方法）成功的转染了肺腺癌 A549细胞株，并在荧光显微镜下观察到了明显的荧光表达。26华中科技大学硕士学位论文Sato, T等8 以荧光素酶做为报告基因，研究各种参数对壳聚糖基因载体的转染效率的影响。结果显示 pGL3/chitosan复合物的转染效率依赖于培养基的pH值、质粒与壳聚糖含量的比值、血清、壳聚糖分子量。他们对不同分子量的壳聚糖进行了对比，结果显示 15和 52kDa的壳聚糖比大于 100kDa组，效率要高，而 1.3 kDa的低聚壳聚糖没有显示出任何的荧光表达；转染时，培养基 pH值在6.9明显比在 pH值为 7.6的
41、培养基中的转染效率高；壳聚糖在含血清的培养基中显示了比阳离子脂质体更好的稳定性。Ishii等29研究认为在以下条件：分子量 40或 84kDa，N/P为 5，培养基含 10%血清且 pH值为 7时，能获得最佳的转染效率。Sato等以收集到的荧光素酶发光信号强度作为转染效率的指标，所以他的研究数据与本实验的比较存在一定的困难。但这些重要的研究结论能解释本实验过程中的现象，数据与本实验的结果是具有一定相似性的。由于实验环境的差异、壳聚糖分子量以及纯化方法不同或其他未知因素，所以，对比和参考仍需要更周全的考虑。本实验用壳聚糖介导转染 shSTA的 A549细胞，以细胞活力检测法分析它对紫杉醇的敏感性
42、指标半数抑制率 IC50（40.984.84 ng/ml）比未处理组（52.682.44 ng/ml）显著降低（P0.05)即壳聚糖-shSTA复合物纳米颗粒（chitosan-shSTA complex nanoparticles ）的转染，明显提高了肺腺癌细胞A549对紫杉醇敏感性。但是，壳聚糖组 IC50提高程度低于脂质体组（ 16.363.31ng/ml）（P0.05）。根据我们研究工作中遇到的问题，综合其他相关研究结论，我们认为壳聚糖具备脂质体所不可比拟的优势：1.安全、低毒，机体耐受好；2.易降解；2.易于获取，成本低廉。但是壳聚糖这种新型纳米材料作为基因转染材料的缺点是：1.对纳
43、米颗粒构建的参数和操作手法的稳定性有很强的依赖；2.转染效率要明显低于脂质体。本实验结果提示的壳聚糖-shSTA复合物纳米颗粒的转染对 A549细胞药物敏感性的提高程度要显著低于脂质体组，主要还是由于转染效率的差异造成的。但是，由于壳聚糖特殊的化学结构特征，它的活性基团可以通过并不复杂的化学合成手段而很容易就被改性和修饰，从而衍生出具备新的理化性质的壳聚糖。壳聚糖的可修饰性不但能改善它的缺点，同时也使它具备了更多未知的潜能。27华中科技大学硕士学位论文比如，壳聚糖改性产物羧甲基壳聚糖，能很好的改善其水溶性。如 M. Thanou等，使用季胺化壳聚糖就良好的改善了壳聚糖的水溶性，从而获得了更好的
44、转染效果32。Chan等利用叶酸 -聚乙烯修饰壳聚糖（FA-PEG-Chi）转染 HEK 293细胞，在提高转染效率的同时，更是使壳聚糖具备靶向功能33。关于修饰性壳聚糖纳米基因载体的应用问题，会将在本课题组下一步的研究工作中的深入探讨和尝试。我们应该乐观的看到，当人们在壳聚糖的分子结构修饰有了飞跃性的突破时，在高度的生物安全性优势面前，壳聚糖作为基因载体的推广甚至到临床应用的这条道路，就不遥远了。28华中科技大学硕士学位论文结 论本实验构建的 shSTA（即 pGU6/GFP/Neo-RNA-stathmin）能高效地、稳定地、靶向地抑制 stathmin基因表达。通过脂质体介导质粒转染，抑
45、制肺腺癌 A549细胞内的 stathmin基因表达，能显著提高 A549细胞对紫杉醇的药物敏感性。以本实验参数和方法构建的壳聚糖纳米载基因颗粒悬液稳定性好，在控制培养基 pH值 6.7-6.9的范围内转染 A549细胞是有效的，具备较好的可重复性。利用壳聚糖这种纳米材料介导质粒 shSTA转染 A549细胞，能提高对紫杉醇的药物敏感性。29华中科技大学硕士学位论文参考文献1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.Ma, Y., C.Y. Chan, and M.L. He, RNA interference and antiviral therapy.World
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