1、上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行
2、检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密 ，在 年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密学位论文作者签名： 指导教师签名：日期：年月日日期：年月日姓名 工作单位 职称 备注上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单上海海洋大学硕士学位论文天然产物对非酶糖基化的抑制作用摘 要非酶糖基化反应指的是氨基化合物蛋白质、氨基酸与羰基化合物还原糖之间发生的一系列非酶促反应，最终产物为非酶糖基化终产物（AGEs）。非酶糖基化与糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆症、肾病等病症密切相关。因此，非酶糖基化的相关研究对于人类健康具有重大意义。目前对于非酶糖基化反应的抑制作用研究正处于初级阶段
3、，以抑制非酶糖基化反应为治疗靶点的药物比较罕见，且氨基胍等疗效较好的抑制剂多对人体具有较强的副作用。因此，研究开发安全、高效的非酶糖基化抑制剂具有重要意义。本文采用果糖与谷氨酸于沸水浴下反应模拟食源性非酶糖基化反应，乙二醛与牛血清蛋白（BSA）于 37下恒温培养模拟生理条件下非酶糖基化反应；检测了非酶糖基化反应中果糖胺、二羰基化合物、5-羟甲基糠醛和荧光性末端产物的生成量，通过上述指标，考察非酶糖基化的反应程度。从黄酮类化合物中选取黄酮醇类代表化合物槲皮素、芦丁和异黄酮类代表化合物葛根素，分析测试了黄酮类化合物对非酶糖基化的抑制作用；从天然多糖中选取壳聚糖与黄原胶在酸性和碱性条件下降解寡糖，分
4、析测试了天然多糖对非酶糖基化的抑制作用。本研究包括以下几个部分：1.黄酮类化合物对食源性非酶糖基化反应的抑制作用研究表明：槲皮素、芦丁和葛根素皆可促进果糖胺的生成，而对二羰基化合物的生成具有较强的抑制作用。槲皮素与芦丁对非酶糖基化反应末端产物表现出显著的抑制作用，芦丁对 5-羟甲基糠醛具有抑制作用。在反应时间为 9 h，样品浓度为 5.0 mmol/L时槲皮素与芦丁对荧光性末端产物的抑制率分别1上海海洋大学硕士学位论文达到 80.5%，66.9% ，其中槲皮素的抑制作用强于氨基胍。而葛根素对荧光性末端产物无显著影响。槲皮素、芦丁与葛根素分子中芳烃基的取代位置不同可能是导致其非酶糖基化抑制能力差
5、异的原因。2.黄酮类化合物对生理条件下非酶糖基化反应的抑制作用研究表明槲皮素、芦丁和葛根素皆促进果糖胺的生成，而抑制二羰基化合物的生成。槲皮素与芦丁对非酶糖基化反应末端产物表现出显著的抑制作用。在反应时间为 9 h，样品浓度为 5.0 mmol/L时，槲皮素与芦丁对二羰基化合物的抑制率分别为 28.8%和 50.5%。而葛根素对末端产物无显著影响，这与食源性非酶糖基化实验结果相似。槲皮素、芦丁与葛根素分子中芳烃基的取代位置不同可能是导致其非酶糖基化抑制能力差异的原因。3.天然多糖及其衍生物对食源性非酶糖基化反应的抑制作用研究表明壳聚糖、黄原胶酸降解与碱降解寡糖皆对食源性非酶糖基化反应的中间产物
6、果糖胺、二羰基化合物和 5-羟甲基糠醛的生成皆具有促进作用；壳聚糖和黄原胶酸降解产物对荧光性末端产物具有促进作用，黄原胶碱降解寡糖对末端产物表现出显著的抑制作用。反应时间为 9h，样品浓度为 1.0mg/mL时，抑制率为 33.3%。而壳聚糖和黄原胶酸降解产物对末端产物具有促进作用。这可能与天然多糖的抗氧化能力和本身含有的还原糖基团有关。4.天然多糖及其衍生物对生理条件下非酶糖基化反应的抑制作用研究表明壳聚糖、黄原胶酸降解与碱降解寡糖对生理条件下非酶糖基化反应的中间产物果糖胺、二羰基化合物和 5-羟甲基糠醛的生成都表现出促进作用；壳聚糖和黄原胶酸降解产物对荧光性末端产物具有促进作用，而黄原胶碱
7、降解寡糖对末端产物表现出较强的抑制作用。反应时间为 8d，样品浓度为 1.0 mg/mL时，抑制率为 41.2%。而壳聚糖和黄原胶酸降解产物对末端产物具有促进作用，这与食源性非酶糖基化的实验结果相一致。这可能与天然多糖的抗氧化能力和本身含有的还原糖基团有关。关键词：非酶糖基化，黄酮类化合物，天然多糖2上海海洋大学硕士学位论文Inhibition of nonenzymatic glycation by natural productsABSTRACTNonenzymatic glycation refers to a series of non-enzymatic reaction betwe
8、en theamino compounds of proteins, amino acids with reducing sugars of carbonyl compounds.The final product is the non-enzymatic glycation end products (AGEs). Non-enzymaticglycation also have been with implicated in a variety of diseases, such as diabetes,atherosclerosis, Alzheimers disease, kidney
9、 disease and other illnesses. Therefore, theresearch of non-enzymatic glycation is important for human health. Because of theirimportance, inhibitors of nonenzymatic glycation have been considered as compounds ofinterest for a long time. For its study is in the primary stage, there is little drugs a
10、stherapeutic targets to restrain the enzyme glycation reaction, and effective inhibitors suchas aminoguanidine usually possess side effects to the human body. Therefore, the researchand development of safe and efficient non enzymatic glycation inhibitor has importantsignificance.In this paper, nonen
11、zymation glycation (of foodborne) was prepared by fructosereacting with glutamic acid in a boiling water bath; nonenzymatic glycation (physiologicalconditions) was simulated by reaction of glyoxal and bovine serum albumin (BSA)incubated at 37 . The nonenzymatic glycation inhibition effects were moni
12、tored throughfructosamine, dicarbonyl compounds, 5 - HMF and fluorescent. The inhibitor in thisresearch includes flavonoids (quercetin, rutin and puerain) and natural polysaccharides(chitosan and xanthan oligosaccharides). This research including several parts as follow:1. Flavonoids were evaluated
13、as inhibitors of foodborne nonenzymatic glycation. Theresults indicated that quercetin, rutin and puerain can promote the generation offructosamine, but they can strongly inhibit the generation of dicarbonyl compounds.Quercetin and rutin showed significant inhibition of end product of nonenzymaticgl
14、ycation; rutin also showed inhibition of 5 - HMF. The inhibition rate of quercetin andrutin (reaction time: 9 h, concentration: 5.0 mmol/L) to the end fluorescent productreached 80.5% and 66.9%. In this assay, quercetin showed better inhibition thanaminoguanidine and puerain, however, showed none in
15、hibition. These results may berelated to the different substituted positions of aromatic hydrocarbon group.2. Flavonoids were evaluated as inhibitors of nonenzymatic glycation under3上海海洋大学硕士学位论文physiological conditions. The results showed that quercetin, rutin and puerarin promote thethe fructosamin
16、e generation but inhibit the formation of dicarbonyl compounds. Quercetinand rutin showed significant inhibition to the end product. The inhibition rate of quercetinand rutin (reaction time: 9 h, concentration: 5.0 mmol/L) to the dicarbonyl compoundsreached 28.8% and 50.5%, respectively. Puerarin ha
17、d no significant effect on the endproduct, which is similar to the experimental results of foodborne non-enzymatic glycation.This may be related to the different substituted positions of aromatic hydrocarbon group.3. Natural polysaccharides were evaluated as inhibitors of foodborne nonenzymaticglyca
18、tion. The results indicated that chitosan, xanthan oligosaccharides (prepared underacidic condition and alkaline condition) all promote the generation of fructoseamines,dicarbonyl compounds and 5-HMF. Chitosan and xanthan oligosaccharides which preparedunder acidic condition have a role in promoting
19、 the fluorescent end product. Xanthanprepared under alkaline condition showed significant inhibition to end product, theinhibition rate (reaction time: 9 h, concentration: 1.0 mg/mL) was 33.3%. These resultsmay be related to the antioxidant activity and reducing sugar content of naturalpolysaccharid
20、es.4. Natural polysaccharides were evaluated as inhibitors of nonenzymatic glycationunder physiological conditions. The results indicated that chitosan, xanthanoligosaccharides (prepared under acidic condition and alkaline condition) all promote thegeneration of fructoseamines, dicarbonyl compounds
21、and 5-HMF. Chitosan and xanthanoligosaccharides which prepared under acidic condition have a role in promoting thefluorescent end product. Xanthan prepared under alkaline condition showed significantinhibition to end product, the inhibition rate (reaction time: 8 d, concentration: 1.0 mg/mL)was 41.2
22、%. These results are similar to the experimental results of foodbornenon-enzymatic glycation, and may be related to the antioxidant activity and reducing sugarcontent of natural polysaccharides.Key words: Nonenzymatic glycation; flavonoids; natural polysaccharide4上海海洋大学硕士学位论文目 录摘 要 . 1ABSTRACT 3引 言
23、. 61.1非酶糖基化反应（NEG）机理 61.1.1非酶糖基化反应过程 . 61.1.2非酶糖基化反应的检测监控 71.2非酶糖基化与人类健康 . 71.2.1非酶糖基化与衰老 . 101.2.2非酶糖基化与糖尿病及其并发症 101.2.3非酶糖基化与老年痴呆症 .111.3非酶糖基化抑制剂的研究进展 12第二章黄酮类化合物对食源性非酶糖基化的抑制作用 . 132.1黄酮类化合物概述 . 132.1.1抗脑缺血作用 132.1.2抗心肌缺血作用 132.1.3抗心律失常作用 142.1.4自由基清除作用 142.1.5肝保护作用 142.1.6免疫调节作用 142.2实验材料和仪器设备 .
24、142.2.1材料与试剂 . 142.2.2仪器与设备 152.3实验方法 . 152.3.1食源性非酶糖基化反应 . 152.3.2果糖胺的测定 152.3.3二羰基化合物的测定 152.3.4 5-羟甲基糠醛的测定. 152.3.5荧光性糖基化产物的测定 162.4结果与讨论 . 162.4.1黄酮类化合物对食源性非酶糖基化反应中果糖胺生成的影响 162.4.2黄酮类化合物对食源性非酶糖基化反应中二羰基化合物生成的影响 172.4.3黄酮类化合物对食源性非酶糖基化反应中 5-羟甲基糠醛生成的影响 192.4.4黄酮类化合物对食源性非酶糖基化反应中荧光性非酶糖基化产物生成的影响 . 212.
25、5本章小结 . 23第三章黄酮类化合物对生理条件下非酶糖基化的抑制作用 . 243.1概述 . 243.2实验材料和仪器设备 . 243.2.1材料与试剂 . 243.2.2仪器与设备 245上海海洋大学硕士学位论文3.3实验方法 . 243.3.1生理条件下非酶糖基化反应 . 243.3.2果糖胺的测定 253.3.3二羰基化合物的测定 253.3.4荧光性糖基化产物的测定 253.4结果与讨论 . 263.4.1黄酮类化合物对生理条件下非酶糖基化反应中果糖胺生成的影响 263.4.2黄酮类化合物对生理条件下非酶糖基化反应中二羰基化合物生成的影响 . 273.4.3黄酮类化合物对生理条件下非
26、酶糖基化反应中荧光性非酶糖基化产物生成的影响 . 293.5本章小结 . 31第四章天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化的抑制作用 . 324.1概述 . 324.1.1壳聚糖生物活性 324.1.2黄原胶及其寡糖生物活性 334.2实验材料和仪器设备 . 334.2.1材料与试剂 . 334.2.2仪器与设备 334.3实验方法 . 344.3.1食源性非酶糖基化反应 . 344.3.2果糖胺的测定 344.3.3二羰基化合物的测定 344.3.4 5-羟甲基糠醛的测定. 344.3.5荧光性糖基化产物的测定 344.4结果与讨论 . 354.4.1天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中果糖
27、胺生成的影响 354.4.2天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中二羰基化合物生成的影响 . 364.4.3天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中 5-羟甲基糠醛生成的影响. 384.4.4天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中荧光性非酶糖基化产物生成的影响 . 394.5本章小结 . 41第五章天然多糖衍生物对生理条件下非酶糖基化的抑制作用 . 425.1概述 . 425.2实验材料和仪器设备 . 425.2.1材料与试剂 . 425.2.2仪器与设备 425.3实验方法 . 425.3.1食源性非酶糖基化反应 . 425.3.2果糖胺的测定 436上海海洋大学硕士学位论文5.3.3二
28、羰基化合物的测定 435.3.4荧光性糖基化产物的测定 435.4结果与讨论 . 435.4.1天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中果糖胺生成的影响 445.4.2天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中二羰基化合物生成的影响 . 455.4.3天然多糖及衍生物对食源性非酶糖基化反应中荧光性非酶糖基化产物生成的影响 . 475.5本章小结 . 49第六章总结 . 50参考文献 . 52致谢 . 58作者攻硕期间的学术论文目录 . 597上海海洋大学硕士学位论文引 言非酶糖基化反应（NEG），又称美拉德反应（Maillard reaction），指的是氨基化合物蛋白质、氨基酸与羰基化合物还原
29、糖之间发生的一系列非酶促反应，最终形成非酶糖基化终产物（AGEs）。非酶糖基化反应由法国化学家 Maillard于 1912年首次发现。Maillard在研究中发现，在食品加工过程中，营养物质之间会产生一系列复杂的反应1。1953年，Hodges对食品体系中非酶糖基化的反应过程做出详细描述2。1955年，Kunkel和 Wallenius3在实验中观察到糖基化血红蛋白的生成，表明在人体内亦存在非酶糖基化反应。此后几十年，科学界对非酶糖基化反应的研究热情与日俱增，非酶糖基化反应人类健康的关系也得到了进一步揭露。近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病及其并发症的发病率显著提高。由于医学界对糖尿病的
30、研究日渐深入，非酶糖基化反应在其中起到的作用越来越受到学者们的重视。研究表明，动脉粥样硬化4, 5、老年痴呆症6, 7等疾病的病发机理和人体老化等生理现象皆与 AGEs有着密切联系。AGEs的来源有人体内含量较高时的血糖与细胞内或细胞外蛋白质反应生成 AGEs和日常饮食中摄入 AGEs两种8。因此，从体内反应和饮食摄入两方面对 NEG反应和其生成物 AGEs进行抑制对人类健康具有重要的意义。1.1非酶糖基化反应（NEG）机理1.1.1非酶糖基化反应过程研究认为，NEG反应分为前期、中期、末期三个阶段9。以葡萄糖与氨基酸的反应为例：在反应前期，葡萄糖的游离羰基与氨基酸中的游离氨基发生可逆的缩合反
31、应，生成席夫碱（schiff base），此化合物再进行可逆的环化反应，生成 N-葡萄糖基胺。N-葡萄糖基胺再经过 Amadori分子重排反应，生成果糖胺（1-氨基 2-酮糖）以及一系列较稳定的酮氨化合物，此步产物称为 Amadori产物。反应中期，果糖胺和 Amadori产物通过多种途径进行氧化、裂解、脱胺、脱水、重排等反应，生成氨基羧酸、糠醛、还原酮类以及一系列杂环化合物。8上海海洋大学硕士学位论文随后，非酶糖基化反应进入末期。此前生成的多羰基不饱和化合物一方面进行裂解反应形成挥发性化合物，另一方面经过缩合反应产生不可逆的蛋白质交联产物，称为非酶糖基化末端产物（AGEs）。1.1.2非酶糖
32、基化反应的检测监控由于 AGEs是一种含有数百种不同种类反应产物的混合物，将其中的物质进行完全分离鉴定十分困难，且一些产物反应活性较强，在分离检测过程中大量损失，影响检测结果。所以对于非酶糖基化反应产物学术界并无统一的检测标准。基于 AGEs的特殊性质，可以使用紫外-可见分光光度法和荧光分光光度发对其进行测定。但是，这两种方法并不具备特异性，只能为非酶糖基化反应进程的监控提供大致判断。近年来，具有特异性的 ELISA法得到长足发展，许多学者使用 ELISA法测定 AGEs取得良好效果。一般来说，非酶糖基化反应产物的检测分为中间产物的检测和末端产物的检测。近几十年的研究已趋于成熟，出现了一些学者
33、们广泛使用的检测方法：1.分子荧光法：一般 AGEs具有荧光特性，据文献报道10，AGEs的荧光激发波长为 300-400nm，发射波长为 350-600nm，目前广泛使用的测定波长为激发波长370nm，发射波长 440nm11, 12。因此，可通过测定非酶糖基化反应物的荧光值来反映AGEs的生成量，此法也是 AGEs测定中使用最广泛的方法之一。2.色谱分析法13, 14：色谱分析的原理是多种物质的混合物在通过色谱柱时由于保留系数的差异而得到分离，从而对其进行定性和定量分析。因此，通过高效液相色谱法可将戊糖苷素、精氨嘧啶、羟甲基糠醛和羧甲基赖氨酸等 AGEs与其他物质分离并作定量分析。高效液相
34、色谱法具有灵敏度高、分辨率高的优点，但步骤较为繁琐，且成本较高，不适用于临床检验。3.酶联免疫法（ELISA）15, 16：酶联免疫法利用待测物质的抗原性而使之与特异性抗体进行竞争性结合，从而反映待测抗原的含量。作为一种近二十年兴起的研究方法，ELISA在非酶糖基化研究领域得到飞速发展。但是，ELISA具有一定的局限性。由于目前还没有出现商品化的 AGEs试剂盒，因此各个实验室间的结果没有统一的标准，无法进行比对。1.2非酶糖基化与人类健康NEG反应在体内及食品体系中广泛存在，其对健康的影响极其显著。近年来越来越多的研究结果证明 NEG反应与人体衰老和众多疾病存在着重要关联。研究表明，9上海海
35、洋大学硕士学位论文在非酶糖基化反映末期，由反应产生的乙二醛、丙酮醛等不饱和羰基化合物、杂环类化合物等与蛋白质形成不可逆的交联结构，并使蛋白质构型的刚性增加，从而破坏人体内重要蛋白质的正常生理功能，导致相关疾病的发生17, 18。而且，非酶糖基化是一个长期稳定的过程，被修饰的蛋白质由于正常代谢受阻而得以在人体内长期累积，这对人体衰老中起到重要作用。1.2.1非酶糖基化与衰老AGEs在血浆和组织中不断累积可导致衰老，这个过程在病理状态下速度加快。AGEs导致衰老的病理作用比较复杂，包括通过非酶糖基化反应对生物大分子如蛋白质和脂质进行修饰，使其理化性质反生改变，生理功能受限，从而引起组织器官的衰老病
36、变。生物体内非酶糖基化反应进行速度缓慢，一般情况下只有某些转换率很低的蛋白质受影响19。但 AGEs与蛋白质不断进行交联反应，参与反应的蛋白质大量增加，而被修饰的蛋白质代谢缓慢，导致 AGEs在体内逐渐积累，具有生理活性的蛋白质受到影响。组织变硬是人体衰老的一个重要特征，其与胶原蛋白的糖基化修饰密不可分20。研究表明，胶原蛋白可与体内含量较高的还原糖发生非酶糖基化反应，形成共价交联的 AGEs，导致胶原蛋白溶解性下降，热稳定性下降，对胶原蛋白酶的抗性加强，从而致使体内关键器官如心、肺和血管、关节等部位的组织硬化，使心肺及其他重要器官功能衰退，与衰老密切相关21, 22, 23。AGEs可修饰含
37、有游离氨基的脂质，产生脂溶性 AGEs。脂质的氧化与非酶糖基化密不可分，在反应过程中生成大量自由基，引发一系列组织损伤24。生成的交联脂蛋白使胆固醇从细胞内排除的能力下降，导致胆固醇在体内大量积累，产生病变和衰老。而交联脂蛋白对巨噬细胞表面的受体的识别能力下降，使交联脂蛋白的清除率下降。还原糖亦可与核苷酸和核酸发生非酶糖基化反应，由于 DNA在体内的半衰期很长，使得 AGEs得以长期累积25。而 RNA的代谢速度较快，故受非酶糖基化影响不显著26。1.2.2非酶糖基化与糖尿病及其并发症糖尿病是一种由血液中胰岛素绝对或相对不足从而导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的疾病27。调
38、查显示，全球 1-2%人口正在受到糖尿病的困扰28。糖尿病患者往往具有长期并发症，如视网膜病变、白内障、动脉粥样硬化、10上海海洋大学硕士学位论文神经病变和肾病等。糖尿病人的平均寿命只有一般人群的三分之二。高血糖症已经在糖尿病患者长期的发病机制中占据了重要的角色，而不良的血液血糖控制尤其带来巨大的风险。此外，在一系列的器官并发症中，神经系统、心脏、肾脏和小血管等器官中细胞在胰岛素浓度很低的情况下对葡萄糖摄取，导致这些细胞内葡萄糖浓度过高从而引发在高血糖症29, 30。高血糖症的引发和糖尿病及其长期并发症的发病机理仍然在研究之中，而蛋白质的糖基化成为一个有吸引力的假说并且在学术界引起了相当大的兴
39、趣。通过使相关酶变性、降低配体结合、改变蛋白质半衰期和降低免疫原性，组织中不断增长和生成的 AGEs对糖尿病及其并发症的发生起重要的作用31, 32。AGEs被证明可促发糖尿病视网膜病变。糖尿病视网膜病变是引发人类失明的重要原因之一，其可使血管分生扩散，发生病理性堵塞梗死，造成血管破裂出血，从而导致视网膜的感染病变 33, 34。研究表明，AGEs使周皮细胞和血管内皮细胞中 RAGE和糖化 mRNA的水平提高，RAGE的上调可能会通过 AGEs导致增加转导信号刺激并可能加剧在糖尿病视网膜病变中周皮细胞的损失35。而事实上，周皮细胞的凋亡和血管变化通常预示着早期视网膜病变。视网膜细胞在 AGEs
40、的作用下有丝分裂素分泌增加，血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度也通过增加 VEGF的基因表达而增加。VEGF可刺激血管增生和新生血管形成，这两者都是增生性视网膜病变的病发原因。VEGF也与血视网膜屏障的病变相关，而血视网膜屏障的病变与视网膜病变中微脉管的增加相关35。AGEs的生成与糖尿病肾病有着密切的联系。糖尿病肾病的病症是基底膜的增厚，肾小球膜的膨胀，通透性的增加和蛋白尿的形成。研究证明肾脏组织中 AGEs水平与糖尿病肾病的严重程度呈正相关。高血糖症和 AGEs浓度的增加可促使-因子（TGF-）的转化，使其含量上升，而-因子会刺激胶原蛋白基质的合成，从而部分地导致糖尿病肾病中基底膜的增
41、厚。胶原蛋白基底膜中累积的 AGEs具有很强的血浆蛋白捕获能力，也可以造成血浆蛋白对基底膜增厚，使肾脏膜的通透性增加，最终使肾小球功能受损36。1.2.3非酶糖基化与老年痴呆症研究表明，非酶糖基化与老年痴呆症有着极大的关联。非酶糖基化参与老年痴呆症的形成最早报道于 1994年,老年斑和神经纤维缠结病理组织中吡咯素和戊糖素的含量呈阳性，且细胞内的 AGEs含量上升了 95%37。AGEs与血红素氧合酶（HO-1）的结合产物在神经元缠结中亦存在。医学界普遍认为，活性氧自由基由 AGEs与 HO-111上海海洋大学硕士学位论文的结合产生，而氧自由基又可促发 HO-1的生成，形成链式反应38。体内试验
42、证明，脱辅基蛋白 E等物质的非酶糖基化使其与肝磷脂的结合能力受损 39。不过对于非酶糖基化与老年痴呆症的直接关系，目前学术界存在不同的看法。除上述几种疾病之外，非酶糖基化还与动脉粥样硬化，骨质疏松，心脏病等病症相关。1.3非酶糖基化抑制剂的研究进展生物体自身存在着应对非酶糖基化反应的保护机制，如-醛糖脱氢酶可使非酶糖基化中间产物 3-脱氧葡萄糖反应活性钝化从而阻止 AGEs的形成40。血浆中的氨基化合物亦可与结合，对蛋白质的非酶糖基化产生竞争性拮抗作用41。然而，当体内保护机制无法使 AGEs降低到正常水平时，就会导致组织和器官发生一系列病变。此时，需要依靠外界药物治疗抑制体内 AGEs水平。
43、AGEs抑制剂的研究发展较快，目前已有不少进入临床应用阶段。AGEs的天然产物类抑制剂大致可分为以下几种：1.黄酮类化合物。目前经研究对蛋白质非酶糖基化有抑制作用的有槲皮素42、芦丁43、儿茶素44 等及其相关衍生物。研究认为，黄酮类化合物对非酶糖基化的抑制作用可能与其自由基清除活性有关45, 46。2.生物碱类。川芎嗪47被证明体外试验中可有效阻碍炎性介质诱发的蛋白激酶 C活化，对蛋白激酶 C通路有一定阻断作用，间接抑制蛋白质非酶糖基化反应。川芎嗪还具有调节血脂及载脂蛋白的作用，从而缓解 AGEs对组织造成的损伤。山莨菪碱48可对早期糖基化白蛋白产物培养下的周细胞增生产生有效地拮抗作用，抑制
44、 DNA的合成，阻止 AGEs初级阶段产物的生成。3.蒽醌类物质。有研究表明，大黄醇提物中存在的大量蒽醌类物质可以使链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖、果糖胺和糖化珠蛋白水平降低，并且减少大鼠体内肾皮质中 5-羟甲基糠醛的含量，从而对糖尿病肾脏组织 AGEs 的形成有抑制作用49。1.4本研究的目的和意义AGEs严重干扰细胞的结构和功能，引起机体损伤，进而导致一系列病症的发生。所以，有效地抑制 NEG和阻断 AGEs的形成对于人类健康十分重要。本论文的目的在于从众多的天然产物及其衍生物中筛选有开发潜力的 AGEs抑制剂，并探讨其抑制机理，为非酶糖基化的抑制剂开发提供参考。12上海海洋大学硕士学位论
45、文第二章黄酮类化合物对食源性非酶糖基化的抑制作用2.1黄酮类化合物概述黄酮类化合物指的是以 2-苯基色原酮为母核衍生出的一类色素，其中包括黄酮的同分异构体以及其氢化的加成产物，即以 C6-C3-C6为基本结构的一系列化合物。黄酮类化合物在生物界分布十分广泛，多与糖结合成苷类，也可以游离形式存在。天然黄酮类化合物一般含有数量较多的羟基，有的还具有甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等。这些助色基团的存在，使得该类化合物多呈现黄色。黄酮化合物物种类繁多，许多具有多种生物活性，对保护心血管、脑血管和肝脏，对抗肿瘤等方面有很强的药理作用50, 51 。此外，某些黄酮类化合物还有降血脂、降血压、抗衰老、提高机体免
46、疫力等药理活性52, 53 。2.1.1抗脑缺血作用研究表明槲皮素、芸香苷54对大鼠急性脑缺血再灌损伤具有显著的保护作用。槲皮素、芸香苷可以改善缺血致脑组织的病理形态学变化，从而延长脑缺血小鼠的存活率；而金丝桃苷对缺血性脑损伤有较强的抑制缺血致脑细胞凋亡、钙拮抗、抗自由基和抑制一氧化氮生成的作用，其抑制机理为阻断脑缺血后脑细胞中的 Ca2+内流。葛根总黄酮也可以增加大脑血流量，显著降低脑血管阻力，体内试验表明其对金黄地鼠的局部脑微血管血流及微循环障碍具有显著改善作用。2.1.2抗心肌缺血作用研究表明金丝桃苷55对缺血再灌心肌的保护作用可能与抗自由基及钙拮抗有关，水飞蓟宾可增加新生鼠心肌细胞对缺
47、氧、缺糖的心肌细胞损伤的促进作用，对心肌缺血损伤有保护作用。木犀草素56可显著增加冠状动脉的血流量并降低冠状动脉血管阻力，并能对抗垂体后叶素引起冠脉血流量下降，对心肌缺血损伤可能有保护作用；沙棘总黄酮能明显减轻缺血再灌大鼠心肌损伤区超微结构的病理改变，降低 MDA含量和提高 SOD活性，表明 TFH对大鼠心肌缺血再灌损伤有保护作用，其作用可能与抗自由基有关。13上海海洋大学硕士学位论文2.1.3抗心律失常作用唐小荷等研究表明山楂籽黄酮57可显著降低乌头碱诱发的室性早搏发生时间，并增加了诱发心律失常所需乌头碱含量，从而说明山楂籽黄酮对心脏具有保护作用。另有研究显示沙棘总黄酮能够延缓房室传导从而减
48、慢心率，减弱心肌收缩力，起到保护心脏的作用。此外，葛根素58等另外一些黄酮化合物也具抗心律失常作用。2.1.4自由基清除作用研究表明大多数黄酮类化合物都有较强的抗自由基作用。芸香苷、槲皮素及异槲皮苷可抑制心脑缺血及红细胞自氧化过程中的 MDA产生，显著提高大鼠血浆、脑组织中 SOD和 GSH-Px等抗氧化酶的活性，其它一些黄酮化合物如甘草黄酮、沙刺总黄酮、艾纳香二氢黄酮等均有清除自由基或抗脂质过氧化作用59。2.1.5肝保护作用研究表明水飞蓟宾60具有显著的保肝作用，保护作用可能与其自由基清除有关。其它一些黄酮化合物如黄芪素、黄芪苷61能抑制肝组织脂质过氧化，田基黄总黄酮62也有降酶、改善肝功
49、能的作用；黄芩苷63对阿霉素引起的肝脂质过氧化有保护作用。2.1.6免疫调节作用黄酮类化合物能增强机体的非特异免疫功能和体液免疫功能。黄酮类化合物可以通过对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、 LAK细胞、细胞因子以及影响胸腺来进行免疫调节作用64。比如金雀异黄素65可抑制动物肿瘤生长，对人体皮肤癌、乳腺癌生长也有抑制；茶多酚66可引起人鼻咽癌细胞株 CNE2细胞 DNA损伤并诱导细胞凋亡。2.2实验材料和仪器设备2.2.1材料与试剂槲皮素、葛根素（生工生物工程股份有限公司）；氨基胍盐酸盐、5-羟甲基糠醛（梯希爱化成工业发展有限公司）；Girard-T试剂、氯化硝基四氮唑兰（国药）； D-葡萄糖、谷氨酸等其他试剂均为国产分析纯。14上海海洋大学硕士学位论文2.2.2仪器与设备DK-S28型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；UV-2000 紫外可见分光光度计（尤尼科）；RF-5301PC荧光分光光度计（岛津）；Waters2695高效液相色谱仪。2.3实验方法2.3.1食源性非酶糖基化反应根据文献方法67加以改动。配制含 0.02
