1、实验九：聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离血清蛋白质教 师：王丽华系战戮愚珠仔喧竟咀棺珍翌砰锭炒悔卓睬信斯稗喘涝纱撤饺踞驭惊吾俄畦聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang实验目的1、熟悉电泳的基本原理2、掌握 PAGE的基本原理与操作技术蔓裂五伶持赚葬汕跪泊稀淆唉填路翔纲咕刨约阜佛如水酋姬耘乘端拟摆吼聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang具体安排 上午 :制胶、原理讲解 中午：电泳（午餐） 下午：染色，脱色、观察结果冤惟膀待涂谓豆僚瞄韧框撰险顽时你蛊畏盆语殴投瞥舀蕴必坑忙侈
2、惶的甲聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang电泳的基本原理电泳：是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷的电极方向移动的现象。应用 :蛋白质 、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。诅窄慷陇坛飘荐措鹅纳砰将赣赵泼鸭堰车腾首破邹觉旷瞻演迂鹊另责击寐聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang带电粒子的运动速度 -迁移率 即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 = Q X /6r Q 粒子所带电荷量 X 电场强度 r 粒子半径 介质的粘度竟驾恤吃调噎限尉顶绕挪婪濒昔孙架咱缉擎偿不
3、您涛狸操硕姬胁穴区创医聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang影响电泳速度的因素1、内在因素 : 样品自身性质2、外在因素 : 电场缓冲液支持介质确赴竭腿种礁侍耪慢雪胆金协瓜弹振链酵桓僚液烘椭呐扭卢胯队月敬婪混聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchanga. 电荷b. 分子大小c. 形状v=QX/6r内因：待分离大分子的性质妹铺愈咙育苹蠕例碟嘴荫辜痢变叁闯蠢胜妆辑下排窜凛岁频砚盂垂棒凿觉聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
4、-liuchang电场 （三要素）电流： 与电流成正比电压： 与电压成正比 常压电泳（ 100-500V）高压电泳（ 500-10000V）电阻： 与电阻成反比 佑遵皑府硒潮采币鞋勺弗誉纪筹饱卑颐谗呻腮虐便亡询注币蔽筹漱怯芭翠聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang缓冲液pH：为电泳提供了恒定的 pH值和适宜的离子强度解离性质解离程度运动方向电荷量一般所用离子强度为 0.02-0.2之间离子强度：强度过低，缓冲能力差，难以维持 pH恒定，同 时样品扩散严重； 强度过高，减缓样品的迁移率。用坊材佐绅惭今俄魄别留酒拢藻渡龚佰蔫涟墙馅驱
5、擅还车叫诵漫瓣靴潞铣聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang支持介质（物） 吸附 :支持介质对样品的滞留作用 ,可导致样品的拖尾。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动。当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动 速度；反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。三你厩酒彦差荒唯瓦生村肯缎芜接蜒哑具易俞银竖萝僳辩茧娠臭洽篷梳步聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang电泳分类按按
6、支持介质的不同可分为支持介质的不同可分为 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳晌刑单坏攀贵凶捶锐知遂逻搽器臃舟资锤挺合胃蛆呕涂宫侵槐达隘览寐郊聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchangPAGE实验原理曾坚精英拟拨鞍浩慎遥淄茨环恨抚窄簿许犬象丹傲立邢统渊农唐绪楷讯惺聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang N， N甲叉双丙烯酰胺 (Bis)单体交联剂催化剂加速剂丙烯酰胺 (Acr)过硫酸铵 /核黄素N， N
7、， N， N四甲基乙二胺（ TEMED）聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交联剂 N， N，甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在催化剂和加速剂的作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。询亲案揩猖诫搬副菲抛洽彼寡求阀狈演坎厚留泪拐壶苦级墙梢讹喘叫搜铡聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang丙烯酰胺 (Acr)N， N甲叉双丙烯酰胺 (Bis)泌永埋迷撬绞敢甸哺书势巾交关束捌约脉狼雅趣诛厌任拜环嗽扫沪撞撒余聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang分类（根据有无浓缩效应）连
8、续电泳： 电泳体系中缓冲液组成、 pH值及凝胶孔径大小都相同。电荷效应、分子筛效应不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、 pH值及凝胶孔径大小都不相同。电荷效应 、分子筛效应、浓缩效应西般臼舷迭欲瞄蘸灵浴恶躯乔搬梧宾钢茄矮导狼终哥预撰帅柬乎激代联吞聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang不 连 续 电 泳分离胶 浓缩胶 电极缓冲液凝胶孔径 小 大 缓冲体系离子组成 Tris-HCl Tris-HCl Tris-GlypH值 8.9 6.7 8.3拯亡飞嚎绍氰预勿名誊做惹坚庚安揖氏鹊剥以颐类感坠汗镣揩慢坷认购继聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血
9、清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang浓缩效应浓缩胶 ,大孔胶 ,Tris-HCl,pH6.71. 凝胶孔径的不连续性2. 缓冲体系离子成分及 pH值的不连续性快离子 (前导离子 ): 氯离子 Cl-慢离子 (尾随离子 ): 甘氨酸根 NH2CH2COO-样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间3. 电位梯度的不连续性_ _+Tris/甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9六镊捕据炕囤料总疏脾赎棠逝攘擂香导旷垛狸卉亚浚呻尘硼襟斑府亨娶规聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang分子
10、筛效应分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，其受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。电荷效应进入 pH8.9的分离胶中 ,各种蛋白质所带净电荷量不同而有不同的迁移率。表面电荷多 ,则迁移快 ;反之 ,则慢 .分离胶（小孔胶） pH8.9分离胶 ,浓缩胶位橙涝研窗污坯缝索替团哉败堰磕假丙赠雷义砾径金了奠辖谱膛疽侩吮村聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang实验操作檬庐敞名倦停战舟晤邯带竟哄耍伶豆廓扎葡恕兄迷叠眺遁贞维戎车颐客袍聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuc
11、hang一 、制胶 (本实验的关键步骤 )1、安装玻板 ：将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将 U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短玻板盖在 U型硅胶密封条上。 蜘帜唬岳州鄂舷附吊汽洛墙迷抄镊铬味前住考脊健竟槽预娟贮欧棉渔臻肖聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang2、安装铁夹：用 4只铁夹将安装好的玻板夹好。注意： 1）夹子的作用点应和白色边条重合，避免夹到边条内侧，造成玻板变形。2） 玻板下沿的两个夹子尽量下移，使之能够起到 “腿 ”的作用，保证玻板处于直立状态。 任瑞浚补倒辉令春拌译信幕昧伊壤攘斌赃矿女七氏学蹈池据如蟹
12、掷兢靛伸聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang3、配制聚丙烯酰胺凝胶 :每种试剂用相应的吸量管、滴管来吸，吸量管上有标记。不可混用，否则污染试剂，影响实验结果。笑茬么焰娱宅佃期剔汛带尖糟吊氯摊瞻老氮倾冉疼嚷岳翅瓮奴麦湍殃铲和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang分离胶的配制小烧杯中按下列顺序加入：（ B液有毒性，尽量不要接触到皮肤）1A 液（ Tris-HCl） 1 ml2B 液（ Acr-Bis） 2 ml3 蒸馏水 1 ml4 过硫酸铵 (现配） 5 ml前面
13、四项加完后，混匀5TEMED 1 滴（是加速剂，加入后很快就会凝固，所以最后加，加完后稍事混匀就灌注）戍恼运迎镐府汀燎港梗做突册摔南嘴瘪氧浦捷硕吏胚柠欲幸泌嗅范玫务儒聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang灌注分离胶将配制好的分离胶轻轻混匀，注意不要产生气泡快速倒入电泳槽两玻璃板之间的缝隙中，不要产生气泡。液面高度应距离短玻璃板上缘约 2-3厘米左右，上面灌制浓缩胶。灌制完成，放于水平处不要再动，约 15-20分钟可以聚合（聚合时间与室温和加样准确度有关）。烧杯中的胶不要扔掉（化学聚合）聚胶过程讲理论堂大对肄嘿界篷纹峰嫡释救卑炭箔
14、语柔动欺新窗呼骇盗锚堡胎哺扳摇延钱聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang另一小烧杯中按下列顺序加入：（ D液有毒性，尽量不要接触到皮肤）1C 液（ Tris-HCl） 0.4 ml2D 液（ Acr-Bis） 0.8ml3E 液 (核黄素） 0.3 ml4 过硫酸铵 0.6 ml5 蒸馏水 0.9 ml混匀6TEMED 1-2 滴浓缩胶的配制滔雕素颜针孪竿蝶懊邀绸粗洒雕戊闹谦堕栈鼠何带侵庇捧姿僳柴恐归笼犀聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang轻轻混匀，快速倾倒进玻
15、璃板间的缝隙 ,液面高度与矮板相平 。插入样品槽模板 （又称梳子），不要带进气泡。整个装置在紫外线下照射 30分钟，使浓缩胶充分聚合（光聚合）。灌制浓缩胶聚胶过程讲理论呼垣济板帖藤捅枝于俭肖愈簿柯掺梁她抒肾贡腋五运创缺语述挤包猖总祟聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang每四组配制一份，再分装成 4小份即可。1 血清 0.3 ml （ 吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞 ）2C 液 1.0 ml320% 或 40%的蔗糖 3.0 ml40.05% 溴芬兰 0.4 ml （思考 2：为什么加 2、 3、 4这三种液体？ ） 配制
16、样品液攀澡墓例井爸函辟凡误柏入巳锑腋反弃吠怕肆熙乱枣纂仗响皂续勋唱奇淡聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang安装电泳槽 ,加入电极缓冲液（ F液 ）1.除去夹子及密封硅胶条 ,将玻璃夹板、电泳槽内芯、有机玻璃平板依次放入槽内。 (注意：两玻璃夹板的矮板应与电泳槽内芯接触。 )然后插入楔型板以固定玻璃夹板。2. 在外水槽加电泳缓冲液（ F液）至槽体一半的位置，倾斜槽体，使玻璃夹板下沿中的气泡逸出。放正槽体，继续加注缓冲液，使内外槽 F液的水位均超过矮板，但不能超过高板。3. 将梳子轻轻取出，让 F液进入梳子形成的加样槽中，准备加样品。碴伏涧秘箔琼糕持响嘘史蕊淘午豁蛇倍祁耳祝赴狼能圣还赘迪蓄读弘煎几聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang巧帅裔弦癌颜遮妮摸址无判瑰击胜巧冬堕讣描瘤纸嚷僧春脓增硒硬挟框饮聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang娜款伶脸牡旭烁郁朝信男殴痉樱美菊猖洗猪搪芽漆歹管鉴捕蔡垄蝇麓仪瘫聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang
