1、1附件 1： 20112016 年周历表2011 年 2012 年周代码 周起始日期 周终止日期 周代码 周起始日期 周终止日期1101 03-01-2011 09-01-2011 1201 02-01-2012 08-01-20121102 10-01-2011 16-01-2011 1202 09-01-2012 15-01-20121103 17-01-2011 23-01-2011 1203 16-01-2012 22-01-20121104 24-01-2011 30-01-2011 1204 23-01-2012 29-01-20121105 31-01-2011 06-02-20
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26、3 10-08-2015 16-08-2015 1633 15-08-2016 21-08-20161534 17-08-2015 23-08-2015 1634 22-08-2016 28-08-20161535 24-08-2015 30-08-2015 1635 29-08-2016 04-09-20161536 31-08-2015 06-09-2015 1636 05-09-2016 11-09-20161537 07-09-2015 13-09-2015 1637 12-09-2016 18-09-20161538 14-09-2015 20-09-2015 1638 19-09-
27、2016 25-09-20161539 21-09-2015 27-09-2015 1639 26-09-2016 02-10-20161540 28-09-2015 04-10-2015 1640 03-10-2016 09-10-20161541 05-10-2015 11-10-2015 1641 10-10-2016 16-10-20161542 12-10-2015 18-10-2015 1642 17-10-2016 23-10-20161543 19-10-2015 25-10-2015 1643 24-10-2016 30-10-20161544 26-10-2015 01-1
28、1-2015 1644 31-10-2016 06-11-20161545 02-11-2015 08-11-2015 1645 07-11-2016 13-11-20161546 09-11-2015 15-11-2015 1646 14-11-2016 20-11-20161547 16-11-2015 22-11-2015 1647 21-11-2016 27-11-20161548 23-11-2015 29-11-2015 1648 28-11-2016 04-12-20161549 30-11-2015 06-12-2015 1649 05-12-2016 11-12-201615
29、50 07-12-2015 13-12-2015 1650 12-12-2016 18-12-20161551 14-12-2015 20-12-2015 1651 19-12-2016 25-12-20161552 21-12-2015 27-12-2015 1652 26-12-2016 01-01-20171553 28-12-2015 03-01-20167附件 2： 流感监测实验技术操作规范一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输（一）流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的采集时间、质量及其保存和运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为
30、气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。常用的采样液有以下三种：pH7.47.6 的 Hanks、Eagles 或者DMEM 培养基。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中可加入抗菌素，加入庆大霉素（终浓度为 1mg/mL，Gibco, cat. no. 15750-078）和/或制霉菌素（终浓度为 50U/mL） 。加入抗菌素以后重新调节pH 值至 7.4，分装每个采样管 3mL，-20 冻存。常用采样方法有以下几种：1. 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头
31、浸入采样液中，弃去尾部。2. 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部。同样将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。83. 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用 35mL 采样液涮洗收集器 3 次。此外，对于尸检组织，必要时采集尸检的肺组织标本进行病毒分离。（二）临床标本运输新鲜采集的临床标本应在 4条件下 48h 内运送至流感监测网络实验室。未能 48h 内送至实验室的，应置-70 或以下保存。标本
32、送至实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h 内能进行检测的可置于 4保存，否则应置-70或以下保存。冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h 内能进行检测的可置于 4保存，否则应置-70或以下保存。标本应避免反复冻融。 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。（三）临床标本处理临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。若为带有聚丙烯纤维的拭子标本，应先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻咽抽取液：用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件
33、下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置 4待其自然沉淀 510min，取上清。上9清液可直接接种或低温保存。组织标本的处理：取肺组织标本放至平皿中，用灭菌生理盐水清洗肺组织 23 遍，研磨成组织悬液，配置成 1020的组织悬液，2000rpm 离心 10min，加入抗菌素，取上清直接接种。注：如原始采样液中未加入抗菌素，应在标本接种前补加，庆大霉素终浓度为 10mg/mL，青/链霉素（终浓度: 青霉素 G 100U/mL,硫酸链霉素 100g/mL） ，混匀后置 4过夜或作用 2h 后进行接种。临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份用于鸡胚接种，一份用于 MDCK 细胞接种，一份保存待复核用
34、。对于病毒分离阳性的原始标本-70至少保存 6 个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安全的有关规定处理。（四）血清标本的采集、处理、运输和保存血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清,单份血清不能用作诊断。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本的同时采集，但不能晚于发病后 7 天。恢复期血样则在发病后 24 周采集。一般采集空腹血。1. 取一根体积 5mL 以上，无菌的血清管做好标记，并进行登记。登记的内容包括：医院名称、患者姓名、性别、急性期（Acute，A）或是恢复期（Convales
35、cence，C） 、采样日期（年，月，日） 。2. 从患者手臂静脉采 5mL 血，放入准备好的上述血清管中。3. 放置于室温数小时待血液完全凝固。104. 15002000rpm 离心 10min，收集血清于无菌管中，做好标记。5. 无菌条件下采集的血清可置 4存放 1 周，非无菌条件下采集的或存放超过 1 周的血清需置-20或以下保存。应尽量避免反复冻融。（五）流感病毒株的运输需送国家流感中心实验室检测的流感毒株，在流感监测信息系统填写“ 流感毒株送检单” ，提交并打印送检单，加盖单位公章。在冻存后，低温条件下，送至国家流感中心进行复核检测，运输时应遵守国家生物安全的有关规定。1. 流感毒株
36、的送检要求（1）流感样病例标本各网络实验室对所有血凝滴度1：16 的流感毒株，同时分别上送国家流感中心和省级疾病预防控制中心，送检量每份不少于 3mL。各网络实验室分离的毒株从标本采集到送至国家流感中心的时间不超过 1 个月。每个开展病毒分离的网络实验室每年向国家流感中心上送不低于30 株流感毒株，流感流行季节每月不少于 5 株。（2）暴发疫情标本分离到的所有血凝滴度1：16 的流感毒株。（3）各网络实验室对于 HA 阳性，但不能区分型别或亚型的毒株须在 48h 内送至国家流感中心。2. 寄送国家流感中心的流感毒株的包装、运输11（1）病毒株必须放在大小适合的塑料管里。盖上盖子后不应有泄漏。（
37、2）必须在塑料管上标明病毒的名称。将密闭后的装有毒株的塑料管放入大小适合的自封袋内密封。（3）在监测信息系统录入病毒株的相关信息，并提交、打印“流感毒株送检单” ，送检单应加盖送检单位公章，送检单应单独放在防水的袋子里。（4）将装有毒株、送检单的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包） ，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。（5）运输时应遵守国家生物安全的有关规定。（六）标本的接收送检的标本（毒株）送到实验室后，由专人在生物安全柜内打开标本的包装，记录收检日期、送检实验室名称、核对并记录送检标本（毒株）编号是否与送检单相同。收到毒株后，国家流感中心 1 个月内在监测信息系统对送检单位
38、反馈复核鉴定结果，并根据送检单位需要，定期反馈纸质报告。二、流感病毒的核酸检测（一）流感病毒 Conventional one step RT-PCR 检测应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。按照规定方法对标本和病12毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。1. 生物安全要求 实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在 BSL-2级实验室操作，采取 BSL-3 级防护；核酸提取及加 RNA 模板可在BSL-2 级实验室生物安全柜内
39、操作；PCR 反应体系配制在体系配制区；PCR 产物检测在电泳区操作。2. 主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）注：*引物序列详见表1。3. 设备（1） BSL-2生物安全柜；（2） 可调转速最大至14000rmp的离心机；（3） 涡旋混合器；（4） 10L，100L，200L，1000L量程移液器；（5） PCR仪；（6） 电泳槽和电泳仪；（7） 凝胶成像系统。4. 质量控制序号 试剂名称 货号 规格 生产商1 One-step RT PCR kit 210212 Qiagen2 引物*（20M) 2OD TAKARA3 RNase inhibitor N2111 Promega
40、13（1） 实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。（2） 实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-time PCR检测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC 处理水 Real-time PCR检测Ct值为0。5. 实验步骤（1） 实验注意事项由于PCR 检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：a) 核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。b) 不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉使用。c)
41、 配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。d) 实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。e) 试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。（2） 设备准备操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。（3） 试剂准备注意：配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温装置中，14如预冷的冰盒。a) 引物配制将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。用RNase Free Water 溶解，加水量为 10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为 100pmol/L，即 100M。（例如：合成引物2OD，9.5n
42、mol，则加水量为 109.595L ），可作为储存液。将100M 的引物浓度再 10 倍稀释，配成浓度为 10M，即可直接用于PCR 反应。b) 引物准备融化引物，振荡所有引物，短暂离心引物，然后放置在低温装置上。c) Conventional RT-PCR试剂将RT-PCR Enzyme Mix放置在低温装置上，融化5RT-PCR Buffer，颠倒混匀。短暂离心5RT-PCR Buffer后放置在低温装置上。（4） 反应体系配制a) 按照如下组分配制反应体系：组 分 体 积（L）5RT-PCR Buffer 5n10mM dNTP Mixture 1nRT-PCR Enzyme Mix
43、1nRNase Inhibitor 0.1n上游引物 0.5n下游引物 0.5nRNase Free Water 11.9n 15Total 20nb) 将上述反应液混匀，分装到 0.2mL PCR 小管中，每管 20L，分别做好标记。c) 加 RNA 模板（在核酸提取区）将上述分装好的 PCR 小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5L 无菌水），然后分别加标本 RNA（每管 5L），最后加入阳性对照 RNA（每管 5L）。（5） 一步法Conventional RT-PCR反应将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入 PCR 仪进行RT-PCR 扩增，反应程序如下：温度 时间（分钟：秒）
44、 循环数60 10：00 142 10：00 150 30：00 195 15：00 194 00：3050 00：3072 01：004072 10：00 14 （6） RT-PCR产物检测a) 1.5琼脂糖凝胶制备：称取 1.5g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1TBE）100mL ，轻轻混匀后加热，使 Agarose 完全熔化。待 Agarose 胶温度降至 5060左右，加入核酸染料（Gold View） 5L，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶的温度降至 50左右16时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约3060min）之后，将梳子拔出。b) 将制备好的电泳
45、胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1TBE ）浸过胶面即可。c) PCR 产物各取 10L，加入 2L 上样缓冲液（6Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加 Marker（DL-2000）5L ，然后依次加标本 PCR 产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。d) 电泳电压 100V，约 3040min 后看结果。e) 将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。（7） 结果说明a) 判读前提：阴性对照未扩增得到条带，阳性对照仅扩增得到特异性条带。b) 阳性结果：根据各检测引物电泳时出现相应大小特异性条带，进行结果判断。c) 阴性结果：未出现条带，或不在相应位
46、置出现非特异性条带，均判为阴性结果。17表 1.流感病毒 One-Step PCR 检测引物引物名称 碱基组成 说明FluA-M-F30 5-TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG-3FluA-M-R264 5-ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG-3用于检测 A 型流感病毒 M基因FluB-NS-F485 5-GGG ACA TGA ACA ACA AAG ATG C-3FluB-NS-R988 5-TGT CAG CTA TTA TGG AGC TG-3用于检测 B 型流感病毒 Ns基因H1HA-F768 5-ACT ACT GGA CTC TGC TGG A
47、AC-3H1HA-R1094 5-CAA TGA AAC CGG CAA TGG CTC C-3主要用于检测季节性 H1N1亚型流感病毒 HA 基因，也可检出部分甲型 H1N1 流感病毒 HA 基因。对疑似标本进行季节性 H1N1 亚型鉴定时，最好使用 Real-time PCR 方法进行检测，以免造成结果的误判。N1-F1059 5-AAG GGG TTT TCA TAC AGG TAT GGT-3N1-R1165 5-TCT GTC CAT CCA TTA GGA TCC-3主要用于检测季节性 H1N1亚型流感病毒 NA 基因，也可检出禽流感 H5N1 亚型病毒 NA 基因及甲型 H1N1
48、 亚型流感病毒 NA 基因。H3HA-F671 5-ATC AGG GAG AGT CAC AGT CTC-3H3HA-R940 5-ATG CTT CCA TTT GGA GTG ATG C-3主要用于检测季节性 H3N2亚型流感病毒 HA 基因N2-F779 5-GGA AAT CGT TCA TAT TAG CCC ATT G-3N2-R955 5-AGC ACA CAT AAC TGG AAA CAA TGC-3主要用于检测季节性 H3N2亚型流感病毒 NA 基因，也可检测出部分禽流感 H9N2亚型病毒 NA 基因H5HA-F248 5-GTG ACG AAT TCA TCA ATG
49、TRC CG-3H5HA-R647 5-CTC TGG TTT AGT GTT GAT GTY CCA A-3主要用于检测禽流感 H5N1亚型流感病毒 HA 基因AN1-F580 5-TGA AGT ACA ATG GCA TAA TAA CWG ACA C-3AN1-R918 5-CCA CTG CAT ATA TAT CCT ATT TGA TAC TCC-3主要用于检测禽流感 H5N1亚型流感病毒 NA 基因，也可检测出部分甲型 H1N1 亚型流感病毒 NA 基因H9HA-F426 5-GAA TCC AGA TCT TTC CAG AC-3H9HA-R808 5-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3主要用于检测禽流感 H9N2亚型流感病毒 HA 基因，AN2-F1121 5-CGC TAC GGT TAT GAG ACT TTC AG-3AN2-R1401 5-ATA TTC GCC CCA TCA GGC CAT GAG-3主要用于检测禽流感 H9N2亚型流感病毒 NA 基因H7-F245 5- CCC AA
