1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, August 25; 24(8): 1348-1353 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000- 2008 Institute of Microbiology, CAS Accepted: February 27, 2008Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30570096), the Ph.D Programs Foundation of Ministry of Educati
2、on of China (No. 20070055011) and the Scientific Research Foundation for Returned Scholars, Ministry of Education of China.Corresponding author: Mingchun Li. Tel: +86-22-23508506; Fax: +86-22-23508800; E-mail: 国家自然科学基金(No. 30570096), 教育部博士点基金资助项目(No. 20070055011), 教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留(2005)546 号) 资助
3、。研 究 报 告 利 用 定 点 突 变 分 析 白 念 珠 菌 依 赖 铁 基 因 FRP1 启 动 子 元件桂 磊 , 梁 勇 , 魏 东 盛 , 郑 雯 , 邢 来 君 , 李 明 春南 开 大 学 微 生 物 学 系 分 子 微 生 物 学 与 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 , 天 津 300071摘 要 : 通 过 对 白 念 珠 菌 高 铁 还 原 酶 基 因 FRP1 启 动 子 进 行 突 变 分 析 , 确 认 启 动 子 中 特 殊 调 控 元 件 。我 们 通 过 分 析FRP1 起 始 密 码 子 上 游 1000 bp 序 列 发 现 在 160 和 650
4、 处 有 2 个 推 测 的 Rim101p 结 合 位 点 , 对 其 分 别 进 行 定 点 突 变 , 然 后 构 建 启 动 子 与 报 告 基 因 LacZ 融 合 质 粒 , 转 化 整 合 到 白 念 珠 菌 rim101-/-株 和 野 生 株 中 , 检 测 不 同 缺 铁 条 件 下 -半 乳糖 苷 酶 活 性 。结 果 发 现 碱 性 条 件 , Rim101p 能 够 正 向 调 控 FRP1 的 表 达 ; 启 动 子 160 处 突 变 对 启 动 子 功 能 影 响 较 弱 , 而650 突 变 使 启 动 子 活 性 大 大 降 低 , 此 结 果 和 双 突
5、变 的 结 果 相 同 , 表 明 Rim101p 主 要 通 过 与 启 动 子 650 处 结 合 位 点 相互 作 用 来 调 控 FRP1 的 表 达 。关 键 词 : 定 点 突 变 , 白 念 珠 菌 , Rim101 蛋 白 , 高 铁 还 原 酶 基 因Regulating Promoter Element of Iron-dependent Gene FRP1 in Candida albicans by Site-directed MutationLei Gui, Yong Liang, Dongsheng Wei, Wen Zheng, Laijun Xing, and
6、Mingchun LiKey Laboratory of Molecular Microbiology and Technology, Ministry of Education, Department of Microbiology, Nankai University, Tianjin 300071, ChinaAbstract: Microarray analysis revealed that the expression of ferric reductase (FRP1) can be regulated by the Rim101 protein. In order to fin
7、d new transcriptional regulatory element in the promoter of FRP1, we analyzed the 1000 bp sequence upstream of ATG to find 2 potential Rim101p binding sites. We generated site-specific mutations in each of the two sites and fused these mutated promoters to LacZ. Then the promoter-LacZ fusion constru
8、ct was recombinant into wild type and rim101-/- strains for - galactosidase assay. The results revealed that the FRP1 was up-regulated in alkaline pH and this was caused by iron starvation. The 650 site, not the 160 site, had an important role in FRP1 Rim101p-dependent expression. We conclude that R
9、im101p may interact with the 650 binding site of the promoter to regulate the FRP1 expression.Keywords: site-directed mutation, Candida albicans, Rim101 protein, ferric reductase gene铁 是 生 物 必 需 的 重 要 营 养 元 素 , 铁 离 子 是 许 多生 化 途 径 , 例 如 呼 吸 作 用 , 三 羧 酸 循 环 , DNA 和 氨基 酸 的 合 成 等 过 程 中 酶 的 辅 助 因 子 , 在 自
10、 然 界 中 , 生 物 体 可 直 接 吸 收 利 用 的 铁 非 常 有 限 , 因 此 微 生 物桂 磊 等 : 利 用 定 点 突 变 分 析 对 白 念 珠 菌 依 赖 铁 基 因 FRP1 启 动 子 元 件 1349J在 长 期 的 进 化 过 程 中 形 成 高 亲 和 的 铁 吸 收 系 统 来 满足细胞铁离子需要。真菌中, 高亲和吸收系统在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中研究最为详细 1,2, 这 个 系 统 主 要 有 3 个 关 键 酶 组 成 , 位 于 细 胞 膜 上 的高 铁 还 原 酶 (Frep)首 先 将 外 界 三 价 铁 还
11、 原 为 二 价 铁离 子 , 后 , 二 价 铁 经 膜 上 多 铜 氧 化 酶 -铁 通 透 酶 (Fet- Ftrp)复 合 物 进 入 细 胞 内 。在 白 念 珠 菌 中 至 少 存 在 14个 高 铁 还 原 酶 基 因 , Simon 等 3首 先 发 现 高 铁 还 原 酶基 因 FRE1(CFL1), 能 够 补 救 酿 酒 酵 母 Scfre1-/-株 造成 的 生 长 缺 陷 。接 着 又 发 现 了 FRE104, 在 pH3.3的 缺 铁 环 境 中 , FRE10 作 为 主 要 的 高 铁 还 原 酶 起 作用 , 目 前 还 不 清 楚 pH 大 于 6 时 究
12、 竟 哪 个 基 因 其 起作 用 , 而 且 至 今 还 没 有 研 究 高 铁 还 原 酶 启 动 子 方 面的 报 道 。RIM101 途 径 是 真 菌 中 保 守 的 应 答 环 境 pH 变化 的 信 号 传 导 途 径 5, Rim101 蛋 白 是 这 一 途 径 的 关键 蛋 白 。通 过 基 因 组 微 阵 列 研 究 比 对 野 生 型 和rim101-/-株 基 因 表 达 情 况 发 现 , 在 碱 性 环 境 下 , 野生 株 中 许 多 基 因 发 生 上 调 , rim101-/-株 中 这 些 基 因并 不 改 变 , 这 里 面 就 包 括 许 多 铁 应
13、答 基 因 如 高 铁 还原 酶 FRP1, 因 此 推 测 FRP1 是 白 念 珠 菌 在 碱 性 环 境下 起 作 用 的 一 个 重 要 的 高 铁 还 原 酶 基 因 , 而 且FRP1 表 达 是 受 Rim101p 调 控 的 。对 FRP1 上 游1000 bp 序 列 分 析 发 现 在 160 和 650 处 分 别 存 在 一个 潜 在 的 Rim101p 结 合 位 点 (见 图 1), 我 们 通 过 对这 两 个 位 点 进 行 定 点 突 变 分 析 来 确 认 Rim101p 作 为调 控 因 子 是 如 何 调 控 FRP1 基 因 表 达 的 。1 材 料
14、方 法1.1 实 验 菌 株 、 质 粒 和 引 物见 表 1、表 2。表 1 本 研 究 使 用 的 菌 株 和 质 粒Table 1 Strains and plasmids used in this workStrains/plasmids Genotypes ReferencesE. coli DH5 SupE44 hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 recA1 Conserved in this labDAY1 ura3:imm434/ura3:imm434 arg4:hisG/arg4:hisG his1:hisG/his1:hisGDAY5 ura3
15、:imm434/ura3:imm434, arg4:hisG/arg4:hisG,his1:hisG/his1:hisGrim101:ARG4/rim101:URA3DAY414 Saccharomyces cerevisiae trppDDB211-D Conserved in E. coli. Ampr, contains LacZ genepDDB78 Conserved in E. coli. Ampr, contains hisG from Candida albicansAwarded by Dr. Dana Davis表 2 本 实 验 使 用 引 物Table 2 The pr
16、imers used in this workName Primer sequence (5-3) UsageP1 catatg tgaaagttaaacttP2 aggtccaagaattaccgatcamplify FRP1promoterE650mut gaacacaacgaagtagccggcaatcggcgactagcaaE650 anti-mutttgctagtcgccgattgccggctacttcgttgtgttcE160 mut ttcgcagttttcggattgccggcatagaaacgataaatE160 anti-mutatttatcgtttctatgccggcaa
17、tccgaaaactgcgaaprimers forpromoter mutationLacZ 5 end gagggggagatgaagttaagLacZ 3 end ggagcccattcagttgcttc detect LacZ geneNote: digestion site is inclined; the putitive Rim101p binding site are underlined and the mutated bases are bold.1.2 主 要 试 剂克 隆 载 体 pGEM-T Easy Vector 及 Ligase 体 系 , 购 自 Promega
18、 公 司 ; DNA 快 速 纯 化 /回 收 试 剂 盒 、IPTG、X-gal、Taq plus DNA 聚 合 酶 、dNTP、各 种 常用 限 制 性 内 切 酶 、核 酸 分 子 量 Marker、T4 DNA 连接 酶 、氨 苄 青 霉 素 等 主 要 购 自 北 京 鼎 国 生 物 技 术 有限 责 任 公 司 和 宝 生 物 生 物 工 程 公 司 , 限 制 性 内 切 酶Drd I、Ase I 等 购 自 NEB, 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 。1.3 培 养 基LB 培 养 基 和 YEPD 培 养 基 7, 培 养 白 念 珠 菌的 YEPD 培 养 基
19、 均 添 加 终 浓 度 为 80 g/mL 的 尿 苷 。TC199 培 养 基 (g/L): TC199 粉 末 一 袋 (9.5 g), 150 mL 1 mol/L HEPES, 1 mL 80 mg/mL 尿 苷 , 加 去 离 子 水至 1 L; 调 溶 液 的 pH 至 4 或 8, 使 用 一 次 性 过 滤 器过 滤 除 菌 。-半 乳 糖 苷 酶 活 性 检 测 菌 体 都 在 TC199培 养 基 中 培 养 , 一 般 在 菌 体 培 养 至 对 数 期 时 通 过 添加 BPS(铁 离 子 螯 合 剂 )或 者 FeCl3 来 制 造 缺 铁 或 者富 铁 环 境 。
20、1.4 CaCl2 法 大 肠 的 转 化 、 酵 母 转 化 (醋 酸 锂 )见 参 考 文 献 7,8。1.5 重 叠 延 伸 PCR 法 对 启 动 子 定 点 突 变推 测 的 白 念 珠 菌 Rim101p 的 DNA 结 合 位 点 为GCCAAGA, 根 据 FRP1 启 动 子 160 处 设 计 带 有 突1350 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech August 25, 2008 Vol.24 No.8J变 位 点 的 引 物 E160mut 和 E160 反 mut, 以 FRP1启 动 子 为 模 板 , 分 别 用 P1、
21、E160 mut 和 P2、E160反 mut, pfu 酶 PCR 获 得 带 有 突 变 的 两 端 片 段 , DNA回 收 试 剂 盒 回 收 纯 化 后 , 以 这 2 条 片 段 (比 例 1:1)为模 板 , P1 和 P2 为 引 物 PCR 获 得 1 条 1000 bp 的DNA 条 带 , 即 为 突 变 完 成 的 启 动 子 PFRP1-160mut。PFRP1-650mut 和 PFRP1-160-650mut 突 变 方 法 同 上 。1.6 -半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 测 定将 转 化 子 接 种 于 35 mL TC199 培 养 基 中 , 30oC振
22、 荡 培 养 至 OD6001.0 时 收 集 菌 体 , -半 乳 糖 苷 酶 活性 的 测 定 见 文 献 9, -半 乳 糖 苷 酶 的 活 性 计 算 公 式 , OD400(颜 色 )1000/OD600(菌 浓 )t(min)3(稀 释 因 子 ) 单 位 为 Miller。2 结 果2.1 FRP1 启 动 子 突 变为 了 确 定 FRP1 启 动 子 中 2 个 潜 在 的 Rim101p结 合 位 点 作 用 , 我 们 分 别 对 这 2 个 位 点 进 行 定 点 突变 , 并 且 进 行 两 位 点 双 突 变 。FRP1 启 动 子 内 不 含Nae I 的 酶 切
23、 位 点 , 突 变 后 引 入 GCCGGC, 可 以 通过图 1 FRP1 启 动 子 中 含 有 2 个 Rim101p 的 潜 在 结 合 位点Fig. 1 Diagram of the putative Rim101p binding sites within the FRP1 promoter桂 磊 等 : 利 用 定 点 突 变 分 析 对 白 念 珠 菌 依 赖 铁 基 因 FRP1 启 动 子 元 件 1351J图 2 质 粒 构 建 图Fig. 2 The process of plasmid constructionNae I 酶 切 验 证 突 变 的 成 功 率 。将
24、 突 变 后 的 PCR 产物 用 Nae I 酶 切 (结 果 见 图 3), 泳 道 4 中 PFRP1 不 能被 Nae I 切 开 , 泳 道 3 中 PFRP1-650mut 能 被 切 出 650 bp 和 350 bp 大 小 的 2 条 带 , 泳 道 2 中 PFRP1-160mut 能被 切 出 160 bp 和 840 bp 的 2 条 带 , 而 PFRP1-160-650mut则 被 切 出 160 bp、350 bp 和 390 bp 三 条 带 , 这 都 与预 期 结 果 相 符 , 说 明 对 FRP1 启 动 子 定 点 突 变 成 功 。突 变 启 动 子
25、 与 pGEM-Teasy 载 体 连 接 转 化 大 肠 杆 菌E. coli DH5, 挑 取 正 确 转 化 子 通 过 测 序 进 一 步 验 证结 果 正 确 。图 3 突 变 启 动 子 Nae 酶 切 验 证Fig. 3 Identification of the mutated promoter by Nae I digestionM: marker ; 14: PFRP1-160-650mut, PFRP1-650mut, PFRP1-160mut, PFRP1, respectively 2.2 FRP1 启 动 子 与 LacZ 融 合 质 粒 的 构 建FRP1 启 动
26、 子 与 pGEM-Teasy 载 体 连 接 转 化 E. coli, 得 到 pGEM-T-PFRP1质 粒 。含 有 嗜 热 链 霉 菌(Streptomyces thermophilus)LacZ 报 告 基 因 的 质 粒pDDB211 经 Nde I 和 Ase I 双 酶 切 , 与 经 Nde I 和 Mlu I(Ase I 的 同 尾 酶 )双 酶 切 的 pGEM-T-P FRP1质 粒进 行 连 接 , 产 生 pGEM- PFRP1LacZ 质 粒 。经 Drd I酶 切 后 与 Not I 和 EcoR I 双 酶 切 的 pDDB78 用 醋 酸锂 转 化 的 方
27、法 共 转 化 到 酿 酒 酵 母 DAY414 中 , 在SC-try 缺 陷 培 养 基 上 筛 选 转 化 子 。2 个 质 粒 的 片 段在 酵 母 中 重 组 后 回 收 质 粒 , 得 到 的 终 质 粒 pNK1000, 质 粒 构 建 流 程 如 图 2。pNK160mut、pNK650mut 和pNK160-650mut 质 粒 构 建 过 程 与 pNK1000 相 同 。质粒 酶 切 鉴 定 结 果 和 PCR 鉴 定 结 果 如 图 4, 与 预 计 片段 符 合 。2.3 FRP1 启 动 子 活 性 分 析质 粒 pNK1000 含 有 与 白 念 珠 菌 his
28、I 基 因 的 同源 区 , 该 质 粒 经 Nru I 酶 切 后 的 片 断 能 够 和 基 因 组发 生 重 组 , 使 得 LacZ 报 告 基 因 插 入 基 因 组 中 表 达 。分 别 转 化 白 念 珠 菌 野 生 型 和 rim101-/-突 变 株 , 转 化子 在 不 同 pH(pH4 和 pH8)、不 同 铁 离 子 浓 度 下 培 养 , 我 们 通 过 比 较 -半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 强 弱 来 分 析FRP1 表 达 的 变 化 与 环 境 pH 和 铁 限 制 环 境 之 间 相互 关 系 (见 表 3)。分 别 以 没 有 转 化 入 质 粒 的 的
29、 野 生 株和 rim101-/-缺 陷 株 为 对 照 1 和 对 照 2, 白 念 珠 菌 中不 含 有 LacZ 基 因 , 因 而 我 们 可 以 通 过 PCR 检 测LacZ 来 确 认 质 粒 是 否 整 合 入 基 因 组 中 。由 表 3 数 据 可 知 : (1)对 照 1 和 对 照 2 无 论 是 在酸 性 、碱 性 环 境 还 是 碱 性 缺 铁 环 境 , 其 -半 乳 糖 苷酶 活 性 都 为 0, 说 明 对 照 1 和 对 照 2 的 -半 乳 糖 苷酶 活 性 是 不 受 酸 碱 pH 和 缺 铁 环 境 影 响 的 , 我 们 所测 得 的 -半 乳 糖
30、苷 酶 活 性 是 完 全 由 转 入 的 启 动 子 启动 LacZ 基 因 表 达 的 结 果 ; (2)含 有 PFRP1-LacZ 片 断的 野 生 型 白 念 珠 菌 在 pH8 时 的 -半 乳 糖 苷 酶 活 性 大于 在 pH4 时 的 活 性 , 差 异 在 10 倍 左 右 ; 在 pH4 条件 下 添 加 BPS 或 FeCl3时 对 菌 株 的 -半 乳 糖 苷 酶 活性 影 响 不 大 ; 在 pH8 条 件 下 在 添 加 螯 合 剂 时 -半 乳糖 苷 酶图 4 终 质 粒 PCR 检 测 和 酶 切 鉴 定Fig. 4 Identification of fin
31、al plasmids by PCR and enzyme digestionM: marker VI ; 14: PCR results of pNK1000, pNK650mut, pNK160mut and pNK160-650mut.;58: pNK1000, pNK650mut, pNK160mut and pNK160-650mut were digested by Bgl II1352 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech August 25, 2008 Vol.24 No.8J活 性 能 提 高 19%, 而 加 入 100 mol/
32、L FeCl3 后 -半乳 糖 苷 酶 活 性 降 低 至 80%; 而 含 有 PFRP1-LacZ 片 断的 rim101-/-突 变 株 中 , 在 上 述 条 件 下 的 -半 乳 糖 苷酶 活 性 都 在 10 左 右 , 所 以 可 以 得 出 : Rim101p 能 够正 向 调 控 FRP1 的 表 达 ; 碱 性 条 件 能 够 造 成 FRP1的 表 达 上 调 ; 碱 性 条 件 造 成 的 FRP1 表 达 的 上 调 是由 于 铁 饥 饿 造 成 的 。表 3 含 有 PFRP1-LacZ 片 断 的 白 念 珠 菌 在 不 同 条 件 下 的-半 乳 糖 苷 酶 活
33、 性Table 3 -Galactosidase assays were performed on PFRP1-LacZ reporter strainsWT rim101-/- Control 1(WT) Control 2(rim101-/-)pH4 5.6 0.25 5.0 0.30 0 0pH8 60 1.17 9.0 0.36 0 0pH4+BPS1 10.5 0.46 6.4 0.28 0 0pH8+BPS 71.2 1.6 12.5 0.86 0 0pH4+FeCl32 5.2 0.35 5.3 0.59 0 0pH8+FeCl3 9.8 0.41 8.6 0.38 0 0Not
34、e: At least three independent transformants were used to determine average Miller units and standard deviations.1 final concentration of BPS was 200 mol/L; 2 final concentration of FeCl3 was 100 mol/L2.4 突 变 启 动 子 活 性 分 析将 突 变 终 质 粒 分 别 转 化 白 念 珠 菌 野 生 株 和rim101-/-中 , 在 不 同 的 环 境 下 培 养 , 检 测 -半 乳 糖苷
35、 酶 活 性 (结 果 见 表 4)。在 pH4 下 , FRP1 各 突 变 启动 子 在 野 生 型 和 rim101-/-株 中 活 性 低 并 且 相 差 不 大 。在 pH8 下 , FRP1 各 突 变 启 动 子 转 化 rim101-/-中 活性 与 pH4 下 基 本 相 同 , 都 在 10 Miller 左 右 。而 转 化野 生 型 菌 株 结 果 显 示 : 1)PFRP1-160mut 启 动 子 活 性 与PFRP1 活 性 基 本 相 同 , 说 明 启 动 子 160 处 突 变 不 影响 启 动 子 功 能 , 2)PFRP1-650mut 和 PFRP1-
36、160-650mut 活 性 大大 降 低 , 与 PFRP1 相 比 , 活 性 降 低 近 10 倍 , 说 明650 位 点 突 变 严 重 影 响 启 动 子 活 性 ; 在 pH8 下 添加 BPS 所 得 结 果 进 一 步 表 明 在 碱 性 缺 铁 环 境 下 , Rim101p 能 够 调 控 FRP1 的 表 达 , 并 且 其 调 控 主 要是 通 过 与 启 动 子 650 处 结 合 位 点 相 互 作 用 来 实 现的 。3 讨 论在 酿 酒 酵 母 中 , ScRim101p 并 非 直 接 调 控 高 亲和 吸 收 系 统 基 因 的 表 达 , 而 是 通 过
37、 抑 制 SMP1 和NRG1 的 表 达 , 间 接 地 促 进 高 亲 和 吸 收 系 统 基 因 的表 达 10。Ana M. Ramon 等 11研 究 揭 示 出 白 念珠 菌 Rim101p 是 转 录 激 活 因 子 , 能 够 直 接 结 合 一 些碱 性 上 调 基 因 上 游 的 启 动 子 区 , 促 进 碱 性 上 调 基 因的 表 达 如 pH 应 答 基 因 PHR1, Yong-Un B 等 9也 发现 Rim101p 在 碱 性 环 境 下 抑 制 pH 应 答 基 因 PHR2表 达 , 并 且 分 析 出 启 动 子 结 合 Rim101p 的 经 典 特
38、异性 序 列 为 CCAAGAA。所 以 在 白 念 珠 菌 中 , Rim101p即 可 以 做 为 转 录 激 活 因 子 促 进 基 因 表 达 , 同 时 还 可以 作 为 抑 制 因 子 抑 制 一 些 基 因 表 达 。本 研 究 发 现Rim101p 能 正 向 促 进 FRP1 表 达 。Rim101p 在 酸 性环 境 下 不 起 作 用 , 因 而 我 们 只 研 究 碱 性 环 境 下 突 变启 动 子 在 野 生 株 和 缺 陷 株 活 性 的 不 同 。通 过 对 启 动子 中 推 测 Rim101p 结 合 位 点 进 行 定 点 突 变 , 构 建 突变 启 动
39、子 与 LacZ 的 融 合 结 构 , 转 化 野 生 型 和 缺 陷型 菌 株 后 , 分 析 转 化 子 -半 乳 糖 苷 酶 的 活 性 的 检 测结 果 发 现 , 在 中 碱 性 环 境 下 , 650 处 突 变 会 严 重 影响 FRP1 启 动 子 活 性 , 而 160 位 点 突 变 则 影 响 不 大 , 说 明 Rim101p 可 能 主 要 通 过 与 启 动 子 650 位 点 相互 作 用 来 调 控 FRP1 的 表 达 。为 什 么 Rim101p 主 要 通 过 与 启 动 子 650 位 点相 互 作 用 , 而 不 是 160? 首 先 一 个 可 能
40、 是 结 合 位 点到 ATG 距 离 影 响 结 合 作 用 , 但 是 这 一 点 明 显 不 充分 , 在 分 析 PHR2 启 动 子 时 发 现 3 个 Rim101p 结 合位 点 , 分 别 位 于 51, 124, 575, 124 是 起 主 要 作用 的 位表 4 含 有 突 变 的 PFRP1-LacZ 片 断 的 白 念 珠 菌 在 不 同 条 件 下 的 -半 乳 糖 苷 酶 活 性Table 4 -Galactosidase assays were performed on mutated promoter reporter strainspNK160mut pNK
41、650mut pNK160-650mutWT rim101-/- WT rim101-/- WT rim101-/-pH4 10.50.43 2.30.30 6.40.51 3.20.33 7.70.41 4.80.27pH8 68.21.02 3.70.45 5.50.28 4.10.52 7.40.53 2.20.19pH8+BPS1 59.50.89 5.10.39 3.20.50 7.20.32 6.90.39 10.50.56Note: At least three independent transformants were used to determine average Mi
42、ller units and standard deviations1final concentration of BPS was 200 mol/L点 。从 图 1 中 可 以 看 出 FRP1 160 和 650 处 序 列 呈 反 向 互 补 , 推 测 认 为 结 合 位 点 的 方 向 影 响 Rim101p桂 磊 等 : 利 用 定 点 突 变 分 析 对 白 念 珠 菌 依 赖 铁 基 因 FRP1 启 动 子 元 件 1353J与 启 动 子 间 的 互 相 作 用 。我 们 将 利 用 EMSA 实 验 近一 步 验 证 Rim101p 与 FRP1 启 动 子 相 互 作
43、用 。生 物 体 通 过 调 控 铁 的 获 得 来 维 持 体 内 铁 的 动 态平 衡 。即 使 在 较 低 浓 度 的 氧 存 在 下 , 游 离 铁 也 是 非常 有 毒 的 , 细 胞 内 游 离 的 二 价 铁 供 出 电 子 , 传 递 给氧 形 成 三 价 铁 和 氧 自 由 基 。因 此 , 细 胞 根 据 外 界 铁的 可 吸 收 性 和 细 胞 内 铁 需 要 程 度 严 格 调 控 铁 吸 收 系统 。从 -半 乳 糖 苷 酶 的 活 性 检 测 结 果 可 以 发 现 在pH8 下 添 加 FeCl3, FRP1 启 动 子 活 性 降 低 到 9 Miller 左
44、右 ; 无 论 在 pH4 还 是 pH8 下 , 添 加 BPS 进一 步 缺 铁 都 会 使 启 动 子 活 性 增 强 , 突 变 启 动 子 也 不例 外 , 所 以 我 们 推 测 还 存 在 其 他 的 转 录 因 子 调 控FRP1 的 表 达 , 很 有 可 能 这 些 转 录 因 子 共 同 作 用 在转 录 水 平 调 节 着 FRP1 基 因 的 表 达 。目 前 在 Candida albcans 中 , 发 现 其 他 特 殊 的 铁 代 谢 调 控 因 子 , 如TUP1 和 SFU1。Tup1p12是 白 念 珠 菌 形 态 发 生 和 代谢 的 一 个 普 遍
45、调 控 因 子 , 通 过 负 调 控 铁 吸 收 系 统 中关 键 组 分 的 基 因 表 达 来 实 现 对 铁 吸 收 的 调 控 。除 了S. cerevisiae 外 的 其 他 丝 状 真 菌 是 由 一 组 GATA-型转 录 因 子 调 节 含 铁 体 合 成 和 吸 收 基 因 的 表 达 , 包 括粟 酒 裂 殖 酵 母 (Schizosaccharomyces pombe)中Fep1p、构 巢 曲 霉 中 Sreap、玉 蜀 黎 黑 粉 菌 (Ustilago maydis)中 Urbs1p, 白 念 珠 菌 中 称 为 Sfu1p13, 基 因组 微 阵 列 显 示 其
46、 能 调 控 铁 吸 收 基 因 , 另 外 有 研 究 显示 Sfu1p 很 可 能 通 过 与 Tup1p 相 互 作 用 调 控 铁 吸 收基 因 的 表 达 。我 们 在 FRP1 启 动 子 序 列 中 也 找 到 了这 两 个 调 控 因 子 的 识 别 位 点 , 这 些 位 点 的 具 体 作 用需 要 通 过 进 一 步 的 突 变 和 缺 失 分 析 加 以 验 证 。另 外我 们 将 对 启 动 子 进 行 缺 失 分 析 , 以 期 找 到 其 他 的 新的 启 动 子 特 殊 调 控 元 件 。致 谢 : 本 文 所 用 的 部 分 菌 株 是 由 美 国 明 尼 苏
47、 达 大学 Dr. Dana Davis 慷 慨 赠 送 , 特 此 感 谢 。REFERENCES1 Daniel JK. Molecular mechanisms of iron uptake in fungi. Mol Microbiol. 2003, 47(5): 11851197.2 Jeane DF, Henri W, Helen P, et al. Yeast, a model organism for iron and copper metabolism studies. BioMetals, 2003, 16: 185197.3 Jane EH, Peter HW, Anne
48、tte MC. Candida albicans CFL1 encodes a functional ferric reductase activity that can rescue a Saccharomyces cerevisiae fre1-/- mutant. Microbiology, 2002, 146: 869876.4 Simon ABK, Gaston V, Emmanuel L, et al. Iron acquisition from transferrin by Candida albicans depends on the reductive Pathway. Infect Immu, 2005, 73: 54825492.5 Eric SB, Samuel JM, Li MC, et al. Transcriptional profiling in Candida albicans reveals new adaptive responses to extracellular pH and
