1、实验十一 碱性磷酸酶的提取、比活性及 Km 测定(综合性实验)碱性磷酸酶的分离提取和比活性测定一、目的要求1. 熟悉从生物样品中提取与纯化酶的一般方法。2. 掌握碱性磷酸酶 (AKP) 比活性的测定原理和方法。3. 了解测定酶比活性的意义。二、实验原理本实验采取有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白，即得到含有 AKP 的滤液，AKP能溶于终浓度为 33的丙酮或 30的乙醇中，而不溶于终浓度为 50的丙酮或 60的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的 AKP。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specific activity)用每
2、mg 蛋白质具有的酶活性单位(u/mgpr) 来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml 样品中的蛋白质 mg 数(mg/m1)； (2)每 ml 样品中的酶活性单位数( U/ml)。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。 本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于 510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong 法)可定义为：在37保温 15min 每产生 lmg 的酚为一个酶活性单位。样品中蛋白质含量
3、测定用 Folin-酚法测定。三、实验器材（一）实验材料1.兔肝 （二）实验仪器1.研钵 2刻度离心管 3移液管 4电动离心机 5玻璃漏斗和玻棒 6.托盘天平 7恒温水浴 8分光光度计 9.剪刀 10.滤纸（三）实验试剂1. 0.5mol/L 乙酸镁溶液：称取乙酸镁 107.25g 溶于蒸馏水中，稀释至 1000ml。20.1mol/L 乙酸钠溶液：称取乙酸钠 8.2g 溶于蒸馏水中，稀释至 1000ml。30.01mol/L 乙酸镁-0.01mol/L 乙酸钠溶液：取 0.5mol/L 乙酸镁溶液 20ml 及0.1mol/L 乙酸钠溶液 100ml，混合后加蒸馏水稀释到 1000ml。40
4、.01mol/L Tris-0.01mol/L 乙酸镁 pH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解并稀释至 1000ml，即为 0.1mol/L Tris 溶液。取 0.1mol/L Tris 溶液 100ml，加蒸馏水约 800ml，再加 0.5mol/L 乙酸镁溶液 20ml，混匀后用 1乙酸调 pH 至 8.8，用蒸馏水稀释至 1000ml 即可。5 丙酮(分析纯)6 95乙醇(分析纯)7 正丁醇(分析纯)8 0.04mol/L 底物液：称取磷酸苯二钠(C 6H5PO4Na22H2O)15.16g 或磷酸苯二钠(无结晶水 )8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，稀释至
5、 1000ml。加氯仿 4ml 盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一周。91mg/ml 酚标准液：称取重蒸酚 l00mg，用 pH8.8 Tris 液配制成 100ml，临用前稀释 100 倍。100.5mol/L NaOH110.3 4-氨基安替比林：称取 4-氨基安替比林 0.3g 及碳酸氢钠 4.2g，用蒸馏水溶解并稀释至 100ml，置棕色瓶中冰箱保存。120.5铁氰化钾：称取铁氰化钾 5g 和硼酸 15g，各溶于 400ml 蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至 1000ml，置于棕色瓶中，暗处保存。130.1mg/ml 蛋白标准液：牛血清白蛋白，用生理盐水稀释至 0.1mg/ml。
6、14碱性铜试剂15酚试剂四、实验步骤（一）AKP 的提取1.取 2g 新鲜兔肝，剪碎后加入 0.01mol/L 乙酸镁-0.0lmoL/L 乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀浆。将匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为 A 液。取A 液 0.1ml 于另一试管中，加 pH8.8Tris 缓冲液 4.9ml 稀释，此为稀释 A 液(1：50)，供测比活性用。2.在 A 液中加入正丁醇 2.0ml，用玻棒充分搅拌 2min，室温放置 20min，用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心(2000r/min) 5min，弃上清液，沉淀加入 0.5mol/L 乙酸镁 4.0ml
7、，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为 B 液。取 B 液 0.1ml 于另一试管中，加人pH8.8 Tris 缓冲液 4.9ml，此为稀释 B 液(1：50)，供测比活性用。（二）AKP 的比活性测定1. AKP 的活性测定：取试管 3 支，按表 1 操作：表 1试剂 ml 测定管 标准管 空白管pH8.8Tris 缓冲液 1.00.04mol/L 底物液 1.0 1.0 1.037水浴预温 5min0.1mg/ml 标准酚应用液 1.0 待测酶液 1.0 37准确保温 15min0.5mol/L NaOH 1.0 1.0 1.00.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 0.5
8、% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0混匀，室温放置 10min 后，510nm 处测吸光度。2. 蛋白质含量测定：取 3 支试管，按表 2 操作：表 2试剂 ml 测定管 标准管 空白管pH8.8Tris 缓冲液 1.0待测酶液 1.0 0.1mg/ml 蛋白标准液 1.0 碱性铜试剂 5.0 5.0 5.0混匀后室温放置 10min酚试剂 0.5 0.5 0.5混匀后室温放置 30min，在 650nm 处比色。测蛋白质时，如采用稀释 A 液，则还需要再用 pH8.8 Tris 缓冲液稀释 l0 倍(此时共稀释 500 倍) 。五、计算六、注意事项1.在纯化过程中，各步加入的有机溶剂量要计算
9、准确。2加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。3在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。碱性磷酸酶的 Km 值测定一、目的要求1通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。2学会用标准曲线法测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。每 ml 待测酶液中AKP 活性单位数（U/ml）测定管的吸光度标准管的吸光度标准管的酚含量待测酶液中蛋白质浓度（mg/ml）测定管的吸光度标准管的吸光度标准管的酚含量AKP 的比活性（U/mgpr）每 ml 待测酶液中 AKP 的活性单位数每 ml 待测酶渡中蛋白质 mg 数二、实验原理在环境的温度、pH 和酶的浓度一定时。酶促反应速度与
10、底物浓度之间的 关系：在反应开始时，酶促反应的速度（V）随底物浓度（ S）的增加而迅速增加；若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(Vmax)。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用 Michaelis-Menten 方程式表示。上式中 Vmax 为最大反应速度， S为底物浓度，Km 为米氏常数(Michaelis- Constant)，而其中的 V 则表示反应的起始速度。当 V=l/2Vmax 时，Km=S所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此 Km 的单位以摩尔浓度(mol/L) 表示。Km 是酶
11、的最重要的特征性常数，测定 Km 值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的 Km 值在 0.01100mmol/L 间。酶促反应的最大速度 Vmax 实际上不易准确测定，Km 值也就不易准确测出。Lineweaver 和 Burk 根据 Michaelis-Menten 方程，推导出如下方程式，即：图 l 底物浓度对反应速度的影响VVmax SKm SKmVmax SVmax SKm S1V 或 1V 11Vmax 此式为直线方程，以不同的底物浓度 1/S为横坐标，以 1/v 为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为1/K m，由此可以正确求得该酶的 Km 值。
12、图 2 Lineweaver-Burk 作图法本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver- Burk 法作图计算其 Km 值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查得酚的含量，进而算出酶活性的大小。三、实验器材（一）实验仪器1.37水浴 2.可见光分光光度计（二）实验试剂10.04mol/L 基质液：称取磷酸苯二钠(C 6H5PO4Na22H2O)10.16g 或无水磷酸苯二钠
13、 8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并定容至 1000ml，加入 4ml 氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一周。20.1mol/L 碳酸盐缓冲液 pH 10（37）：称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至 1000ml。3碱性溶液：取 0.5mol/L NaOH 和 0.5mol/L NaHC03 各 20ml，混合后加蒸馏水到 100ml。40.5铁氰化钾：取铁氰化钾 5g 和硼酸 15g 各溶于 400ml 蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至 1000ml，置棕色瓶中，暗处保存。50.3 4-氨基安替比林：4-氨基安替比林 0.3g 及 NaHC
14、O3 4.2g 用蒸馏水溶解，并稀释至 100ml，置棕色瓶中，4保存。6酚标准液(0.10mg/1.0m1)：(1) 称取结晶酚 1.50g，溶于 0.1mol/L HCl，定容至 1000ml 为贮备液。(2) 标定：取 25ml 上述贮备液，加 0.1mol/L NaOH 55ml，加热至 65，再加入0.1mol/L 碘液 25.0ml，盖好放置 30min，加浓 HCI 5ml，再以 0.1淀粉作指示剂，用 0.1moL/L 硫代硫酸钠滴定，反应如下：3I2+C6H5OH C6H2I3(OH)+3HII2+2 Na2S2O3 2 NaI+Na2S4O6根据反应，3 分子碘(Mw=25
15、4) 与一分子酚(Mw=94)起作用，因此每毫升0.1mol/L 碘液(含碘 12.7mg)相当于酚的毫克数为：25ml 碘液中被硫代硫酸钠滴定者为 X ml，则 25ml 酚溶液中所含酚量为：1.567mg(25 X)(3)应用时，按标定结果用蒸馏水稀释至 0.1mgml 作为标准液。四、实验步骤（一）底物浓度对酶促反应速度的影响12.79.432541.5671. 取 6 支试管编号，按表 3 操作： 表 3试剂(mI) l 2 3 4 5 60.04mol/L 基质液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.00 pHl0，0.1mol/L 碳酸盐缓冲液 0.70 0.70
16、 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.00 0.90 0.80 0.70 0.30 1.10 37水浴中保温 5 分钟血清 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 最终底物浓度 mmol/L 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.002. 加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置 37水浴中准确保温 15min。3. 保温结束，立即加碱性溶液 1.0ml 终止反应。 4. 各管分别加入 0.3 4-氨基安替比林 1.0ml， 0.5铁氰化钾 2.0ml，充分混匀，放置 15min，以 6 号空白管作对照，于 510nm 波长处比色测定，根据酚
17、标准曲线计算出每管样品酚的含量，算出反应速度。5. 以各管底物浓度的倒数(1/S)为横坐标，以各管反应速度的倒数 (1/V)为纵坐标，作图求出 Km 值。若用兔肝，则需将新鲜兔肝用 pH l0.0 0.1mol/L 碳酸缓冲液匀浆，按 20 倍稀释即可，其操作按表 4 进行：表 41 2 3 4 5 6 0.01mol/L 基质液 0.13 0.20 0.30 0.50 1.00 0.00 pH10，0.01mol/L 碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.70 1.00 0.90 0.70 0.20 1.20 37水浴中保温 5min兔肝稀释匀
18、浆液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10最终基质液浓度 0.65 1.00 1.50 2.50 5.00 0.00（二）酚标准曲线的绘制1. 取洁净干燥试管 6 支，按表 5 依次加入试剂；表 5l 2 3 4 5 6 0.1mg/mI 酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.6037水浴中保温 5min碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1. 0 1.0 0.3%4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 各管的吸光密度 2. 混匀后室温放置 15min，于 510nm 波长处比色。3. 以酚含量(g)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线。五、 【结果】1. 请将表 3 到结果填到下表试管号 1 2 3 4 5 6吸光密度反应速度反应速度的倒数2. 酚标准曲线的绘制3. 作图求出酶的 Km 值。六、 【注意事项】1血清取量要准确。2标准曲线必须是过原点的一条直线。七、问题与讨论1. 论述 Km 值和 Vmax 的意义（苑红 编）
