1、酶解发酵工艺对配合饲料粗蛋白质和干物质消化率的影响杨雪海 1，2 李绍章 赵娜 魏金涛 严念东 张巍 郭万正 黄少文 1 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064 2 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064摘要：本试验通过体外消化法，研究了不同工艺酶解发酵部分原料对配合饲料粗蛋白质和干物质消化率的影响。试验结果表明：酶解发酵同时进行的生产工艺配合饲料粗蛋白质消化率较空白对照组、单酶解组和单发酵组分别提高了 11.19%、7.43%、7.48%，差异显著（P0.05） ，干物质消化率有提高的趋势，但差异不明显（P0.05） 。酶解和发酵等新型生物技术在饲料产业中的应
2、用是未来饲料行业发展的必然趋势。植物蛋白饲料原料经酶解发酵后可明显降低抗营养因子的含量、增加小肽和游离氨基酸的含量（张健等，2012；王刚等 2011） 。经酶解发酵处理的植物蛋白具有易吸收、低抗原等特点，被认为是动物饲料的理想蛋白来源(李绍章等，2004；范彦令等，2006；Feng 等，2007)。这对于提高动物饲料植物蛋白利用率、缓解原料不足具有重要的意义。体内消化率能够比较准确地对饲料营养价值进行评价，但耗时、费力，很难在短时间内对饲料样品进行评价。而体外消化是模拟试验动物的消化生理条件，以动物消化道内酶液或人工酶液为消化酶，利用酶促反应的原理，在试管、三角瓶等容器内对饲料物质进行离体
3、消化水解作用，具有简单、快捷、重复性好等特点，在饲料营养价值评定方面占有重要位置(Bassompierre 等，1997；Chong 等 2002；张铁鹰等，2005)。目前，大多数试验研究局限于原料酶解发酵后消化率的测定，但对酶解发酵工艺及酶解发酵部分原料后对配合饲料消化率的影响却鲜见报道。本试验通过体外消化法研究不同工艺条件下酶解发酵部分原料对配合饲料粗蛋白质和干物质消化率的影响，为饲料的酶解发酵工艺及酶解发酵饲料在实际应用中的效果奠定理论基础。1、材料1.1 液态基料玉米和豆粕按质量比 1:3 混合均匀粉碎过 1.5mm 筛片。1.2 固态配合饲料全价配合饲料中除掉液态基料后的剩余植物蛋
4、白原料，具体配方组成见表1。表 1 固态配合饲料配比名称 含量（%）玉米 76.14豆粕 10.15麸皮 6.34膨化大豆 6.341.3 酶解发酵剂菠萝蛋白酶购置于广西生物技术有限公司，酶活 120 万 IU/g，批号20120524；酵母购置于湖北安琪酵母股份有限公司，活菌含量 200108cfu/g,批号 20120428。1.4 生化试剂胃蛋白酶（1：3000）及胰蛋白酶(1:250)购置于 sigma 公司，浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇等化学试剂均购自中国医药集团上海试剂公司。1.5 主要实验仪器恒温培养箱、全自动凯氏定氮仪 FOSS 2300、干燥箱、上海理
5、达 PSH-25C酸度计、抽气机。2、方法2.1 试验设计与处理试验设计与处理见表 2。表 2 实验设计与处理编号 处理方式A 空白对照B 单独酶解（菠萝蛋白酶）C 单独发酵（酵母）D 酶解+发酵（同时添加菠萝蛋白酶和酵母）E 先发酵最后 4 小时酶解（酵母发酵 20h 后酶解 4h）F先酶解（作用 4 小时后灭活）+发酵（酶解 4h 后灭活酵母发酵 20h）2.1 液态酶解发酵饲料的制作分别称取 20g 液态基料于 250ml 的烧杯中，按实验处理每克液态基料分别添加 107cfu 酵母，菠萝蛋白酶按质量分数 1%添加，加入 70ml 的实验室用水，置37恒温培养箱中，酶解发酵 24h。2.
6、2 配合饲料的制作酶解发酵液态基料 24h 后，置于 80的烘箱中灭活 10-15min，加入 80g 固态配合饲料，充分搅拌均匀，于 65烘箱中烘干备用。2.3 体外消化的测定2.3.1 样品处理粉碎上述备用饲料样品，过 50 目筛，装入广口瓶中密封，低温保存。2.3.2 胃消化阶段准确称取 1g 饲料样品（精确至 0.0001g） ，置于 100ml 具塞三角瓶中，向瓶中加入 15ml 磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0） ，小心混合均匀后，加入 10ml 0.2 M HCl 溶液，将食糜 pH 值调整至 2.0（用 1M 的 HCl 或 1M 的 NaOH） ，然后加入1ml 新鲜的 20
7、 mg/ml 胃蛋白酶盐酸溶液(1500 U/mL, 0.18 mol/L HCl)or (内含 3 000U/ng+0.18 mol/L HCl),，并使 pH 仍保持在所设 pH 值。加入 0.5ml 细菌生长抑制剂（0.5%氯霉素乙醇溶液） ，用橡胶塞封口。于 40恒温水浴摇床中（120次/min） ，放入 5min 后开始计时，消化时间为 4 h/6h。2.3.3 小肠消化阶段待胃消化阶段结束后，向食糜中加入 10ml 磷酸缓冲液（0.2M，pH 6.8） ，和5ml 0.6M 的 NaOH 溶液，调整食糜 pH 至 6.5（用 1M 的 HCl 或 1M 的 NaOH） ，然后加入
8、1ml 50 mg/ml 猪胰酶 ( sigma P-1790)溶液,并使 pH 值仍保持在所设 pH值。用橡胶塞封口后，于 40恒温水浴摇床中（120 次/min） ，放入 5min 后开始计时，消化时间为 18h。2.3.4 小肠消化期结束消化残渣收集及指标检测 在消化残渣中加入 5ml 20三磺基水杨酸，室温下放置 30min，将三角瓶中的残留物用 1磺基水杨酸溶液完全冲洗到漏斗中，真空抽滤，最终将残渣连同已知重量的无氮滤纸置于 105烘箱中烘干至恒重，称重，并测定残渣蛋白。2.4 蛋白质的测定蛋白质的测定参照 GB/T 6432 饲料中粗蛋白质测定方法进行。2.4 干物质消化率的测定干
9、物质消化率的测定参照澹台炳琰等（1992）的方法进行。2.5 pH 的测定将酶解发酵的液态基料搅拌均匀，称取 5.0g 于 45ml 的蒸馏水中，用三层纱布过滤后用酸度计直接检测滤液的 pH 值。2.6 数据处理数据采用 SAS6.12 的 t-test 进行两组均数的差异显著性检验。3、结果与分析3.1 酶解发酵对液态基料的 pH 值的影响不同酶解发酵工艺对液态基料 pH 值的影响见表 3。不同酶解发酵工艺的 pH值 24h 后有明显降低的趋势，但各处理间差异不显著（P0.05） 。表 3 不同酶解发酵工艺过程中 pH 变化情况不同处理方式时间 A B C D E F0h 6.300.02a
10、 6.260.01a 6.300.03a 6.260.02a 6.300.01a 6.260.04a24h 4.280.05a 4.270.03a 4.460.06a 4.620.02a 4.510.01a 4.450.03a注：同行肩标不同者表示差异显著（P0.05）3.2 不同酶解发酵工艺对配合饲料粗蛋白质消化率的影响不同酶解发酵工艺对配合饲料粗蛋白质消化率的影响见表 4。由表中数据可知，酶解发酵同时进行的生产工艺粗蛋白质消化率较空白对照组、单酶解组和单发酵组分别提高了 11.19%、7.43%、7.48%，差异显著（P0.05） ，表 4 不同酶解发酵工艺对配合饲料粗蛋白质消化率的影响处
11、理方式 配合饲料粗蛋白消化率（%）A 70.130.02aB 72.590.38aC 72.550.52aD 77.980.49bE 75.060.64bF 77.330.57b注：同列肩标不同者表示差异显著（P0.05）3.3 不同酶解发酵工艺对配合饲料粗干物质消化率的影响不同酶解发酵工艺对配合饲料粗干物质消化率的影响见表 5。各处理组间干物质消化率差异不显著（P0.05） 。表 5 不同酶解发酵工艺对配合饲料粗干物质消化率的影响处理方式 配合饲料干物质消化率（%）A 29.750.87aB 29.620.46aC 29.390.35aD 32.351.67aE 31.330.62aF 31
12、.270.58a注：同列肩标不同者表示差异显著（P0.05）4、讨论4.1 酶解发酵对日粮酸化的影响幼龄动物，由于自身消化系统发育不完善，胃酸和消化酶分泌不足，常使胃肠道 pH 高于酶活性和有益菌群生长的适宜范围，必须依赖外源性饲料来帮助改善消化道中的酸碱环境，因此，对胃酸分泌不足的幼龄动物有较好的使用效果 （朱碧泉等，2008；石宝明等，1999） 。此外，日粮酸化还能有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌等几种有害的肠道细菌的生长和繁殖，减少动物肠道疾病的发生（李军等，2011） 。本次试验研究中，饲料原料经液态酶解发酵后基料的 pH值达到 4.6 左右，这可能与酶解发酵产生的小肽、游离氨基酸和大量丰
13、富的有机酸有关。较低 pH 值的液态基料与固态配合饲料混合也可能是酸化配合日粮、减少配合饲料杂菌的另一技术途径之一。4.2 酶解发酵有利于蛋白质消化率的提高植物蛋白经酶解发酵后，大分子蛋白质被分解成小分子蛋白质、寡肽、小肽和游离氨基酸（李绍章等，2004；马文强等，2008；柯祥军等，2008） ，易被幼龄动物胃肠道完整吸收，有利于提高机体对饲料养分的消化利用率 。章世元等（2008）报道日粮添加 17.5%和 35%发酵豆粕提高了断奶仔猪蛋白质消化率。刘宁等（2009）报道酶解豆粕显著提高了肉仔鸡对干物质、粗蛋白质、能量、钙和磷的消化率，表明酶解豆粕较普通豆粕更有利于肉鸡对养分的消化利用。
14、本试验在液态情况下，采用酶解发酵同时进行的生产工艺，配合饲料粗蛋白质体外消化率较空白对照组提高了 11.19%，体外消化试验进一步证实了饲料原料酶解发酵后有利于该原料消化利用率的提高。4.3 酶解发酵对干物质消化率的影响饲料营养物质消化率是影响动物生长的重要因素。经酶解发酵后，不同工艺条件下配合饲料干物质消化率与对照组有提高的趋势，但差异不显著（P0.05） 。这和刘宁等（2009）报道的酶解豆粕在生产中提高了肉鸡配合饲料的干物质消化率不一致，这可能是体内消化和体外消化的差异造成的。5、结论试验研究表明酶解和发酵同时进行的生产工艺，能显著提高配合饲料粗蛋白质的消化率（P0.05） ，有提高干物
15、质消化率的趋势（P0.05） ，这对酶解发酵饲料在实际生产中的应用具有重要的理论意义。参考文献1马文强,冯杰,刘欣微生物发酵豆粕营养特性研究J中国粮油学报，2008,23（1）：121-124.2李绍章，梁运祥大豆发酵降解的多肽在养殖生产中的应用J.饲料广角，2004,7:36393 Feng J，Liu X，Liu Y Y，et a1Effects of Aspergillus oryzae 3.042 fermented soybean meal on growth performance and plasma biochemical pararneters in broilersJAni
16、m Feed Sci Technol，2OO7，134：2352424刘宁,张权益,等. 酶解豆粕对肉鸡生产性能和养分消化率的影响J.中国畜牧兽医,2009,36(11):9-11.5澹台炳琰,张兆兰,等.猪离体消化试验的不同处理方法对饲料干物质和蛋白质消化率的影响J. 河北农业大学学报, 1992, 1:56-60. 6石宝明,单安山饲用酸化剂的作用与应用J饲料工业，1999，1：137朱碧泉,曾秋风，丁雪梅，等.复合有机酸和黄霉素对肉鸡生产性能及肠道微生态的影响J中国家禽,2008,30(6)：1417.8李军,卢玉飞,等.复合酸化剂的日粮酸化作用及对营养物质表观消化率的影响J.中国饲料,
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