1、样品取回后，冻于-70 冰箱中。样品包括组织样和血清样品。检查目的基因的表达情况。需要作的工作如下：1、首先是组织总 RNA 的提取。提取步骤见 TRNZOL 试剂说明书。2、组织 mRNA 提取后进行反转录，得到 cDNA 样品。3、以 CDNA 样品为模板进行特定基因的扩增（可先用普通 PCR 验证/为了验证表达的差异，应采用定量 PCR，并选用内参基因）注意：为了让提取的 RNA 质量可靠，每次研磨的组织样品不能过多，这就要求我们在取样是不能取太多的样品，而且所取样品必须准确、可靠。否则会导致后续试验都不准确。一 总 RNA 提取准备工作：、（一）基本器材和试剂1 实验器具与材料 （1）
2、 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 枪头：1ml、200ul、20ul （3） 枪头盒：1ml 一个,200ul 和 20ul 的枪头盒至少一个 （4） EP 管 1.5ml、100ul （5） 研钵:据一次提取 RNA 样品多少定.（6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 广口瓶几个（配 75乙醇，盛放氯仿，异丙醇等用） 2 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP 管等） 将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC 水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水）37过夜,然后送至高压锅灭菌(121-126 )至少 30 分钟，后在 60-70
3、烘烤箱中烘干，试验前将枪头放入枪盒。 优级耗材可直接使用。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在0.1%DEPC 水中泡 8 小时左右(过夜)，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤(100-200)3 次。 （3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤 3 次。 （不需要泡 DEPC水） 3 试剂配制和准备（1） DEPC 水：泡实验器具的 DEPC 水的配制： 1000ml 双蒸水中加1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。DEPC 处理水的配制： 100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加40ulDEPC， 37过夜，送至高压去除未反应的
4、DEPC。 （2） 75乙醇（最好在抽提时现配）：用无水乙醇和 DEPC 水配制（DEPC 水:无水乙醇 1:3),然后放于-4预冷备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 。（4） 氯仿：放入棕色瓶 。（5） Trizol：100ml/瓶 存放于 4。 4. 抽提 RNA 工作台面准备1.在仅用于 RNA 抽提的超净工作台抽提 RNA2. 工作台面用用 RNAase 失活剂处理。（二）总 RNA 提取步骤：1. 采样样品采集需均一，迅速，组织样品避免血液污染，样品采集后迅速置于液氮或是-70.2.样品的研磨:先用少许液氮将研钵冷却,然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末，取约少 10
5、0mg 样品于预先加入 1mlTrnzol 的 EP 管中,用力颠倒混匀，室温静置 5 分钟,充分裂解细胞。 3.加入氯仿向每管中加 0.2ml 氯仿。盖紧管盖，用漩涡振荡仪振荡 15s（也可用手用力振荡1 分钟左右） ，使其充分混匀，静置 2-5min。 4.离心分离4 下 12000g 离心 15 分钟, 样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约 500 l）转移到新管中，注意不要吸取到蛋白层。5. 转移上清 将含有 RNA 的上层清液转移到新的 1.5mlEP 管中后（约 500ul),再加入 0.5ml 异丙醇,轻轻混匀后静置 10 分钟6
6、RNA 沉淀然后 4 12000g 离心 10 分钟,弃上清。离心前 RNA 沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。 7.RNA 洗涤加入 1ml 75%乙醇(4 摄氏度预冷)，轻轻洗涤沉淀,4，7500g5min，弃上清。注意在倒出液体时不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。此步可重复.8. 晾干室温放置晾干（不要晾的过干，RNA 过分干燥后会很难溶解，大约晾干 23分钟左右，见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可）9.溶解根据实验需要及得到 RNA 量的多少，加入 30-100 l 无 RNase 水，反复吹打、混匀，充分溶解 RNA。为了保证
7、RNA 的浓度在可用范围，可使用 20-30l 水溶解。若浓度过大可再稀释。预防RNase 污染，应注意以下几方面：1 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染。2 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。3 RNA 在 TRNzol 试剂中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150烘烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4 配制溶液应使用无 RNase 的水。 （将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度
8、0.1%( v/v)，放置过夜，高压灭菌） 。TRnzol 法抽提总 RNA 流程图液氮研磨组织并取样约 100mg ,加入预先盛有 1mlTRnzol 的 EP 管中振荡混匀后，室温 5 分钟加氯仿 1/5 体积（0.2ml） （必须按总体积的 1/5）旋涡仪振荡混匀 15S， （用手使劲摇动 1 分钟替代）室温静置 2-5 分钟4，离心 12000g，15 分钟转上层水相（约 400-500l）于另一新 1.5mlEP 管中加等体积异丙醇（约 400 -500l） ，混匀后室温 10 分钟4，离心 12000g，10 分钟弃上层清液后，加 4 度预冷的 75%乙醇（用高压后的 DEPC 水
9、配）1ml4离心 7500g，5 分钟弃上清，可短暂离心后，用枪吸取多余的液体，空气干燥约 30 分钟（不能完全干燥）溶于 DEPC 处理水中至 30l（20 l-30 l ）（可在 55-60水中，10 分钟助溶）融解 RNA立即保存于 -70超低温冰箱中，或立即用于逆转录注意:1. 样品量和 Trizol 的加入量一定要按组织 100mg ,1mlTRIzol 的比例，不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解2.实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。二RNA质量和浓度检测分别采用 1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测所
10、抽提的总 RNA 的质量和浓度。1 琼脂糖凝胶电泳检测抽提的 RNA 的质量： 取 10TBE 缓冲液 20ml 加水至 180ml，配成 1TBE 缓冲液； 称取 1.0g 琼脂糖置于 200ml 锥形瓶，加入 100ml1TBE 缓冲液，加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀； 待琼脂糖胶液冷却至 5060（手感容器能耐受）时，加入 5l Goldview，摇匀； 倒胶：迅速放好梳子后将凝胶缓缓倒入制胶膜中。凝胶的厚度在 35mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。凝胶通常需要在室温中放置 3045min。凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应
11、高出凝胶表面 1mm 小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整； 加样：用移液枪将 RNA 液和 6载样液在无 RNA 酶的离心管中混匀，点样于样品孔中，并同样加 DNA Marker 于点样孔； 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则证明电泳槽已经接通电源。100V 电泳 0.5h，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时，停止电泳； 观察和照相：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下，观察是否出现两条完整的条带：28S 和 18S，分别为 4800bp 和 1900bp，如果完整，则说明 RNA 质量可靠，并在凝胶成像系统下照相保存图片
12、。2 核酸蛋白检测仪检测 RNA 的浓度：取 5l 总 RNA 和 45l1TE 于比色杯，用枪头混匀，在 RNA 程序下测样品相应数值，即：样品号，260nm 吸光度，280nm 吸光度，320nm 吸光度，260/208nm 吸光度比值，样品稀释倍数，样品中 RNA 的含量（g/ml ，ng/l） 。3. DNase处理 用无 RNase 的 DNase处理，消除总 RNA 中痕量 DNA 的污染，操作步骤如下： 在微量离心管中配制下列反应液，总量 50l；总 RNA 30g10DNaseBuffer 5lDNase（RNase-Free,5U/l） 2lRNase inhibitor （
13、40U/l ） 0.5lDEPC H2O 12.5l 37反应 2030 分钟； 加入 50l 的 DEPC H2O； 加入 100l（等量）的苯酚/氯仿/异丙醇（25:24:1 ） ，充分混匀； 13，200rmp 离心 5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中； 加入 100l（等量）的氯仿/异丙醇（24:1） ，充分混匀； 13，200rmp 离心 5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中； 加入 10l（1/10 量）的 3M 醋酸钠（PH5.2） ； 加入 250l（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20放置 3060 分钟，以沉淀RNA； 13，200rmp 离心 15min，
14、弃上清； 缓慢加入 75%乙醇 200l，13，200rmp 离心 5min 以清洗沉淀，弃上清。重复清洗一次，弃上清，用离心机短暂离心 10s，用 Tip 头吸干残留乙醇； 空气干燥 10min（注意：切勿过分干燥，否则 RNA 将会很难溶解且A260/280 会小于 1.6） ，加 30l DEPC H2O 溶解 10min，样品保存于-80三反转录（一）准备工作 1 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP 管 1.5ml、200ul 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP 管等） 将塑料制品逐个浸泡于 1DEPC 水
15、中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水） 37过夜，然后送至高压至少 30 分钟，后在 60-70烘烤箱中烘干（或置于 37中 8 小时左右烘干） ，试验前将枪头放入吸头台。 优级耗材可直接使用.3，试剂配制和准备： （1）DEPC 水：泡实验器具的 DEPC 水的配制：1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时 后备用。逆转录中所用的 DEPC 水的配制：100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37过夜，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP 管中，-20中保存备用。 （2）RT 中所需要的各种试剂 1,RT 试剂盒.2
16、,DEPC 处理水或生化专用的 RNase-free 水.3,10uM 浓度的引物.（二）RT 步骤 用 RT 试剂盒进行转录（10ul 体积） 。1， 准备 200u 的 EP 管 2， 冰上操作：按试剂盒说明书进行反应体系的配制.3， 配制好后,轻轻振荡以混匀样品,用小离心机将所有样品都离至管底。 4， 按说明书上的反转录条件在普通 PCR 仪上进行反转录.5， 反转录完成后,其管内产物即为 PCR 的模板 .以 10UL 的反应体系来说,每次反应所需的模板量仅为 1UL.6， 分装处理并做好标记,为了保证模板的完整性,应对反转录后的模板进行分装.分装后-20 保存,PCR 进再单管取样
17、,减少模板冻融次数。 1.按下列组分配制 RT 反应液（在冰上进行，总体系 10l）5Prime scriptTM Buffer 2lPrime scriptTM RT Enzyme Mix 0.5lOligo dT Primer（50M） 0.5lRandom 6mers（100M） 0.5lTotal RNA 4lRNase Free dH2O 2.5l2.轻轻混匀后 7500rmp 离心 35sec；3.在下列条件下进行反转录反应：37，15min， （ 反转录反应） ；85 ，5sec（ 反转录酶的失活） ；4.反转录产品-20保存待用。四普通 PCR（一）引物的稀释在引物合成回来后，
18、立即存放于20 冰箱内。由于引物合成的量很少，稀释前先用离心机高速离心（10,000rpm，1min ） ，将 DNA 制品的粉末都离心至管底，然后加上引物 nmol*10 体积的无菌水，轻轻上下振荡 5-10 分钟，再次离心 10,000rpm，1min，制成 100uM 的保存液，再取少许别稀释成 10&20uM 工作液，原液或工作液20 保存。这样即可以减少引物被污染的机会，又可以减少因多次冻融而使引物降解或断裂，进而影响实验结果。在溶解 DNA 制品是，我们是先将其制备成 100uM 的保存液，然后再稀释成实验浓度。配制 100uM 的保存液的方法。灭菌水的使用量：体积（ ul）nmo
19、l 数*10.1umol=1000nmol=1000000pmol1uM=1umol/L=1nmol/ml=1pmol/ul（二）PCR 准备1、实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）枪头盒：放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 （4）EP 管 1.5ml、200ul 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP 管等）送至高压 30 分钟次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1)超纯水： 100ml 盐水瓶内装 40ml 超纯水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP 管中， -20中保存备用。 (2) P
20、CR 中所需要的各种试剂: Master-mix ， cDNA 模板，rimer，无ase 水（三）PCR 步骤1， 准备 200ul EP 管2， 确定各成分的添加量(参照试剂盒说明).3， 在冰上操作,并放置在设定程序的 PCR 仪4， 再电泳检测结果5， 1.取 0.2mlPCR 管，依次加入下列试剂（PCR 总反应体系为 10l）：第一链 cDNA 1l上游引物（10M） 0.5l下游引物（10M） 0.5l2Taq PCR MasterMix 5lddH2O 3l五荧光定量1、实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul 、1000ul（2）吸头：200ul、10ul、100
21、0ul（3）枪头盒：1000ul、200ul、10ul（2 个）（4）EP 管：1.5ml、200ul （5）白管：低位白色八联管2.反应体系1.取 0.2mlPCR 管，依次加入下列试剂（PCR 总反应体系为 10l）：第一链 cDNA 1l上游引物（10M） 0.5l下游引物（10M） 0.5l2Taq PCR MasterMix 5lddH2O 3l反应体系（总体系为 12.5l）：SYBR Premix Ex TaqTM（2） ，6.2.5l ；上游引物（10M） ，0.25l；下游引物（10M） ，0.25l；第一链cDNA， 1l；ddH 2O，4.75l 。其中 SYBR Premix Ex TaqTM（2）内含MgCl2、Taq HS（HotStar Taq polymerase，热启动酶） 、dNTP 、SYBR Green等。3.反应程序反应程序：预变性：95 ，1min；扩增：95，5s；60，30s；共40 个循环； 融解曲线： 95，0s；50，30s；95 ，0s（温度变化速率为0.5/s） 。反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。采用双标准曲线法计算各基因 mRNA 的相对表达量。
