1、1,第十一章 核酸的体外扩增 聚合酶链式反应 连接酶链反应 RNA的体外扩增,2,第一节 聚合酶链式反应,polymerase chain reaction PCR,3,PCR的发明： 发明人：Kary Mullis。1983年，Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，即PCR。 1985年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中引起了巨大的反响。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。随后 Cetus给了Mullis一万美元的
2、奖金，然后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物技术公司。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。,4,Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。,在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项突破。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值，并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。,5,一、PCR的基本原理类似于D
3、NA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与待扩增DNA发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,6,flash,7, DNA模板变性双链DNA是通过95左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。 模板与引物退火 4555，两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。 引物延伸72左右在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下，DNA聚合酶将单核苷酸从引物3端掺入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板。,
4、8,以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般需进行25-30轮的循环。,9,PCR flash,10,二、PCR引物的设计,引物引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸，两段引物分别与相应的一条DNA链3端及5端互补。,11,引物的设计一般遵循下列原则：,.上游引物与目的DNA端序列完全相同； 下游引物与目的DNA端序列互补 .引物长度以15-30个碱基为益；G+C含量为45-55 .引物内、引物间不应有互补序列 . 碱基分布随机 .引物与非特异扩增区的同源性不超过70% 6. 3端必须互补， 5端可游离,12,三、模板的制备,DNA 1.从细胞中
5、提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,13,四、PCR的基本反应,（一）、以DNA为模板的反应：10缓冲液 10 l 4种dNTP混合物 各200 mol/L 引物 各10100 pmol 模板DNA 0.12 g Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol/L 加双蒸水至 100 l,14,PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖
6、性 无校正功能,15,（二）以mRNA为模板的反应,mRNA 5 l 5 Buffer 4 l dNTP 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20u) 逆转录酶 1 l(10u) Oligo(dT)12-18(或下游引物) 1 l ddH2O 6l /20 l 42水浴1小时，95 水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：,16,10 Buffer 5 l 25mmol/L Mg2+ 3l Taq酶 0.5 l（2.5u） 上游引物 1l ddH2O 20.5l /50 l 按PCR循环参数进行 RT-PCR,17,（三）PCR产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促
7、动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期 。（30个循环） “平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。,18,（四）PCR反应的自动化,19,五、PCR反应条件的控制,（一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 1050mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L,
8、20,（三）底物浓度 dNTP浓度在20200 mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,21,（五）引物 引物浓度一般为0.1 0.5mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95/ 30 60s 退火温度和时间 4555/30 60s 延伸温度和时间 72 1min 3min 循环次数 2530 不超过35,22,六、PCR中应注意的事项,PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带,23,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操
9、作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,注意的事项：,24,七、PCR反应的特点,1.特异性强： 2.灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6g)水平 3.简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。 4.对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,25,八、PCR技术的主要类型,不对称PCR
10、差异显示PCR RT-PCR 单链构象多态性PCR 锚定PCR 俘获PCR 反向PCR RAPD,26,一、不对称PCR(asymmetric PCR)1.原理：二种不同浓度的引物(50:1)，25个循环，低浓度的引物耗尽，高浓度的引物介导PCR反应，结果产生大量单链DNA。2.用途：快速大量地制备单链DNA(杂交探针) 。,27,二、逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 1.原理：RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低浓度的mRNA被扩增放大易于
11、检测。RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。,28,三、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR)原理：在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。,29,30,四、反向PCR (inverse PCR, IPCR) IPCR是扩增已知DNA序列两侧的未知序列。其原理是：用限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物，再用切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR，也可将环化DNA线性化后再进行PCR。,31,32,五、随
12、机引物PCR (AP-PCR， RAPD)1.原理： RAPD是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链为引物(随机引物) ，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，检测扩增DNA片段多态性。 2.用途：用于进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。,33,六、差异显示PCR(differential display,DDRT-PCR)原理：见图,34,35,七、单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)原理：单链DNA分子因单一核苷酸不同，其二级结构有所差异，PCR产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同。
13、通过比较DNA的电泳类型，即可测出突变。其优点是所需样品DNA量极少，灵敏度高，可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选多个样品。,36,八、多重PCR (multiplex PCR)1.原理：多对引物同时扩增几个不同的DNA片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。 2.应用：检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变。,37,如：杜氏营养不良症(DMD)：,X染色体短臂Xp21区抗肌萎缩蛋白基因的突变或部分缺失,38,39,第二节 连接酶链反应,Ligase chain reaction LCR,40,一、LCR的基本原理,
14、LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5磷酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的循环反应。,41,42,二、LCR产物的检测,标记引物： 放射性标记 荧光素标记 地高辛标记,43,三、影响LCR的重要因素, 引物 基因的突变位点 长度足够 LCR的反应条件,44,第三节 RNA的体外扩增 RNAPCR,45,转录依赖的扩增系统(transcript-based amplification system, TAS) 自主维持序列扩增或再生式序列复制（self-sustained sequence replication,3SR) 核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based
15、 amplification, NASBA）,46,一、基本原理,以RNA为模板在体外大量扩增RNA 非循环相 逆转录 转录 循环相 聚合酶链式反应 反应体系温度均一 RNA产物以10的指数方式增加,47,48,酶： 逆转录酶，RNase H, T7RNA聚合酶 引物： 引物A与RNA3端互补，5 端含启动子 引物B与cDNA第一条链3端互补 底物：dNTP, NTP 模板： 缓冲液：,RNAPCR反应体系的组成,49,二 、产物的检测：分子杂交 三、RNAPCR技术的特点及应用 特点： 扩增效率极高 特异性强 应用： 检测RNA，RNA测序，临床诊断,50,小 结,1.掌握PCR、RT-PCR、连接酶链反应（LCR）、RNA-PCR的基本原理， PCR引物设计的基本原则。 2.了解PCR技术的其它类型；,
