1、2009-2010 学年第二学期 07 应用化学班仪器分析实验 反相高效液相色谱法分析甲苯和联苯 1反相高效液相色谱法分析甲苯和联苯一、目的要求1 理解反相高效液相色谱法的基本原理及影响组分保留值的因素。2 学习用反相高效液相色谱法分析混合芳烃。3 掌握HPLC 分析的定性、定量方法。4 理解流动相组成对样品组分保留时间的影响。二、方法原理用非极性的十八烷基键合固定相，多以甲醇-水或乙睛-水作为流动相（极性流动相），用以分离非极性或极性小的化合物，该方法是目前最常用的反相液相色谱法。化学键合固定相是在薄壳型或全多孔硅胶微粒上，通过化学反应把有机分子键合到无机担体表面。其优点是固定相表面更加均匀
2、一致，能灵活的改变吸附剂表面性质，提高选择性，增强稳定性，延长柱的寿命。反相键合相的保留机制是疏水效应起主导作用，所以样品组分的疏水性差异是分离的基础。对非离子型化合物，分子极性愈大，保留值愈小；对非极性化合物，分析表面积愈大，保留值愈大；在同系物中链愈长、苯环愈多，保留值愈大。流动相也影响被测组分的保留值，流动相的表面张力愈小，保留值愈小。在常用的溶剂中，以水的表面张力最大，因此流动相中水的含量减小，流动相的表面张力下降，组分的保留值减小。本实验分离甲苯、联苯2 种芳烃的混合物，由于苯环个数或分子的表面积有显著差别，因此在反相高效液相色谱中得到很好的分离。用保留时间定性，根据峰面积标准工作曲
3、线定量。三、仪器与试剂1仪器：Shimadzu LC-10ATVP 高效液相色谱仪，检测器为SPD-M10Avp 二极管阵列检测器。10uL HPLC 微量进样注射器。超声波清洗器及玻璃器皿。2试剂：甲苯、联苯、甲醇等试剂均为A.R.级。二次蒸馏水。标准混合储备液：1.00mg/mL 甲苯、联苯的甲醇溶液。3色谱条件：色谱柱：Shimadzu VO-ODS（4.6150mm）C18 分析柱流动相：A 液：水；B 液：甲醇。用前用超声波脱气。UV-检测器，检测波长254nm。进样体积：10uL;流动相流速：1.0mL/min。样品：甲苯、联苯的混合甲醇溶液。四、试验步骤1开启色谱仪，先开启泵、在
4、线脱气机、柱温箱、检测器，再开启系统控制器，最后开启电脑。2双击CLASS-VP 软件，双击 PDA 检测器，打开文件，设立新方法，设置流动相A 液和B 液的比例为1：9，流动相流量为1.0mL/min,柱温为40，检测波长为254nm，使其正常运行。3标准溶液的配制：分别移取0.1mL,0.3 mL, 0.5mL 标准溶液储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。各溶液的浓度分别为：0.010mg/mL, 0.030 mg/mL, 0.0500 2009-2010 学年第二学期 07 应用化学班仪器分析实验 反相高效液相色谱法分析甲苯和联苯 2mg/mL。4标准工作曲线的绘制：分别注入不同浓度
5、的标准溶液10.0uL, 记录色谱图。以峰面积对各组分的进样量绘制标准工作曲线。5试样的测定：注入样品溶液10.0uL,记录色谱图，由工作曲线计算未知样品中甲苯和联苯的含量。6改变流动相的配比（1：9；0：10），观察色谱峰保留时间的变化。7改变柱温（40，30），观察色谱峰保留时间的变化。8实验结束时，用甲醇冲洗色谱仪液路系统和注射器，然后按照与开机相反的顺序关机。五、结果处理1.以峰面积对各组分的含量绘制标准工作曲线。2.根据保留时间进行定性；对试样各组分依据峰面积由标准工作曲线求得各组分的含量。3.计算不同流动相配比和柱温条件下，两峰的分离度。六、注意事项1.正确使用微量进样注射器，并保持其洁净。抽取试样时，注射器内部不得存留气泡，针头残存液体要用滤纸吸干。2.吸取不同试液时，先用甲醇冲洗干净，再用要抽取的试液抽洗3 次后，方能抽取进样。使用完毕，须用甲醇抽洗干净后存放。七、思考题1.解释色谱图上观察到各组分的出峰次序。2.解释在不同的色谱条件下，色谱图上观察到的谱峰保留时间和分离度的变化。3.若相邻组分没有达到完全分离，你将采取什么措施使其完全分离？为什么？
