1、超声波提取防风色原酮的研究作者：韩忠明，杨荣艳，王云贺，韩梅，孔伟伟，杨利民【摘要】 目的优选防风色原酮的超声波提取工艺。方法以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量为指标 ,采用正交实验法优选超声波提取防风色原酮的最佳工艺。结果最佳提取条件为料液比为 130 ,超声时间 45 min ,超声温度 50 ,超声频率 90 kHz。结论采用超声波提取技术提取防风色原酮，提取时间短，提取效率高，可用于防风色原酮的提取。 【关键词】 超声波; 防风; 色原酮; 正交实验 ; 高效液相色谱Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction co
2、nditions of chromone from Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. by ultrasonic wave. MethodsThe contents of prim O glucosylcimifugin, cimifugin, 5 O methylvisammioside and sec O glucosylhamaudol were served as indicating indexes, and the extraction conditions were optimized by orthogonal test.
3、ResultsThe optimal ultrasonic condition was as follows: the feed-liquid rate was 130; the extractive time was 45 min; the extractive temperature was 50 and the supersonic frequency was 90 kHz. ConclusionThe extraction of chromone from S.divaricata with ultrasonic wave is found to be a rapid and effi
4、cient extraction method with short time and high production yield.Key words： Ultrasonic wave; Saposhnikovia divaricata; Chromone; Orthogonal test; HPLC防风 Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.为伞形科防风属多年生草本植物 ,以未抽薹的干燥根入 药，是我国常用大宗中药材之一，具有解表祛风、胜湿、止 痉功能，用于感冒头疼、风湿痹痛、 风疹瘙痒、破伤风等1治疗。现代药理研究工业化其主要的活性成分为升麻
5、素苷、升麻素、5 O 甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等 ,具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种功效24。超声波法提取中药有效成分是近年来发展起来的一种新方法 ,具有设备简单、操作方便提取时间短、效率高和节能等优点5。有关超声波提取防风中色原酮的研究已有报道6 ,但仅仅以升麻素苷和 5 O 甲基维斯阿米醇苷两种色原酮为指标 ,而现在评价防风药材则以升麻素苷、升麻素、5 O 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷 4 种色原酮为主要药效物质和质量控制评价指标7。本文以升麻素苷、升麻素、5 O 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷 4 种色原酮的质量分数为指标 ,对超声波提取防风中 4
6、种色原酮的工艺参数进行了研究 ,为防风综合开发利用提供有效的提取方法和科学依据。1 仪器与材料DL-1000E 超声波清洗器( 上海之信仪器有限公司); Agilent 1100高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、DAD 检测器、手动进样器和Agilent 化学工作站) ; AUY 220 电子天平(日本岛津) 。提取用甲醇为分析纯(北京化工厂) 和 HPLC 用甲醇为色谱纯甲醇(Fisher 公司)。实验材料系 2007 09末采于白城 GAP 基地 3 年生未抽薹防风的根 ,经吉林农业大学张连学教授鉴定为伞形科柴胡属防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) S
7、chischk.。对照品由中国药品生物制品检定所提供 ,升麻素苷、升麻素、5 O 甲基 维斯阿米醇苷 、亥茅酚苷 批号分别为 111522，111710，111523，111714。2 方法与结果2.1 防风 4 种色原酮的 HPLC 测定2.1.1 色谱分析条件 Diamonsil C18 (4.6 mm200 mm ,5 m) 色谱柱 ;柱温 30 ;波长 254 nm ;甲醇-水梯度洗脱 ：甲醇：015 min :20% 45% ，1525 min :45%70% ;流速 1 mlmin-1。2.1.2 供试品溶液的制备防风根经 45 烘干 ,粉碎过 30 目筛。精密称取 0.3 g 样
8、品 ,浸泡 2 h ,按照不同因素-水平进行超声提取 ,过滤 ,定容于 100 ml 容量瓶中 ,过 0.45 m滤膜 ,精密吸取 20 l进样 ,按外标法测定。2.1.3 混合对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷适量 ,配成浓度为 :升麻素苷: 0.3 mgml-1，升麻素: 0.04 mgml-1，5-O-甲基维斯阿米醇苷: 0.5 mgml-1 和亥茅酚苷 0.02 mgml-1 的混合对照品溶液。分别精密量取 0.25，1，2，3，4，5 ml ,定容于 10 ml 容量瓶中。2.1.4 标准曲线的制备 分别吸取上述对照品溶
9、液 20 l按色谱条件进样 ,测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标(Y) ,进样量为横坐标(X) ,绘 制标准曲线 ,计算回归方程。升麻素苷 :Y = 3 288. 853 74 X + 68.774 277(r= 0.999 85) ,线性范围 :0.153 g ;升麻素 :Y = 2 578.415 45 X + 7.520 469(r = 0.999 72) ,线性范围 0.020.4 g ;5-O-甲基维斯阿米醇苷 :Y = 2 010 X + 68.751 405(r = 0.999 59) ,线性范围 0.255 g ;亥茅酚苷 :Y = 4 125.812 67 X + 5.313
10、809(r= 0.999 71) ,线性范围 0.010.2 g。混合对照品和供试品的色谱图见图 1。图 1 混合对照品 (a) 和供试品 (b) 的 HPLC 图（略）2.1.5 稳定性实验精密吸取混合对照品溶液 20 l ,按色谱条件每隔 4 h 进样 1 次 ,共测定 7 次。 计算 4 种色原酮峰面积。结果升麻素苷、升麻素、5 O 甲基 维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的 RSD 值分别为 0.98%，1.63%，1.53%和 0.99%。表明 24 h 内 4 个对照品稳定性良好。2.1.6 精密度实验精密吸取混合对照品溶液 20 l ,按上述色谱条件进行分析 ,连续 5 次。计算 4 种色原
11、酮 峰面积积分的 RSD 值分别为 0.91%，1.54%，1.76%和 1.95%。2.1.7 重复性实验 精密称取防风样品 5 份，按上述操作方法制备供试品溶液 ,分别精密吸取供试品溶液 20 l ,按照上述色谱条件测定峰面积 ,结果 4 种色原酮峰面 积积分的 RSD 分别为1.74%，2.68%，2.30%和 2.16%。2.1.8 回收率实验取已知含量的供试品 5 份 ,分别加入定量的升麻素苷、升麻素、5 O 甲基维斯阿米醇苷及亥茅酚苷对照品 ,按上述色谱条件测定。计算 4 种色原酮的回收率 ,结果升麻素苷平均回收率为 104.72% ,RSD 为 1.57%(n= 5) ;升麻素平
12、均回收率为 104.98% ,RSD 为 1.64%(n= 5) ;5-O-甲基维斯阿米醇苷平均回收率为 104.93% ,RSD 为 1.41%(n= 5) ;亥茅酚苷平均回收率 为 104.47% ,RSD 为1.53%(n= 5)。2.2 单因素分析2.2.1 料液比对总色原酮提取率的影响精密称定 0.3 g 防风样品 ,分别准确加入甲醇 3 ml(料液比 110)、6 ml(料液比 120)、9 ml(料液比130)、12 ml(料液比 140)和 15 ml(料液比 150)在相同的条件下考察料液比对提取率的影响 ,结果总色原酮质量分数依次为 0.932 1% ，0.953 8%，0
13、.962 3%，0.965 6%，0.966 6% 。可见在一定范围内 , 随着料液质量体积比的增加，提取率增幅增大，在料液比为 130 处达到最大。当料液比继续增加时，总色原酮提取量的增加幅度较小。鉴于节约溶剂的原则 ,故将料液比定为 130 左右。2.2.2 超声时间对提取率的影响在料液比 130 ,其它条件相同下选择时间 15，30，45，60 ，75 min 进行超声萃取 ,结果总色原酮质量分数依次为 0.932 5%，0.966 9%，0.986 3% ，0.989%，0.990 6%。可以看出，随着超声波提取时间的加长，总色原酮提取率的增幅不断减少，这可能由于提取率正在接近最高值，
14、并且由于在提取过程中杂质的不断增加，影响了色原酮提取量的继续升高。因此选择 45 min 左右进行正交实验。2.2.3 超声频率提取率的影响在料液比 130 ,其它条件相同下选择超声频率 30，50，70，90 kHz 进行超声萃取 ,结果总色原酮质量分数分别为 0.905 1%，0.974 4%，1.008%，1.014 4%。随着超声频率的增加 ,总色原酮的提取率不断增加 ,考虑超声波仪器本身的频率限制 ,故将频率定为 70 kHz 左右。2.2.4 提取温度温度过高杂质溶出增加; 温度过低 ,影响色原酮在甲醇的溶出。因此，综合考虑 ,选择 30，40，50进行正交实验。2.3 正交 实验
15、设计 及个因素水平设置 根据单因素实验结果 ,选取料液比(A)、超声 时间(B)、超声温度(C)和超声频率(D)为主要考察因素 ,各因素及水平 设置见表 1。正交实验采用 4 因素 3 水平正交表即 L9 (34) 正交表进行实验 ,结果见表 2 ,并对 4 种色原酮总量进行极差分析及方差分析。结果见表 34。表 1 因素水平（略）以总色原酮为考察指标 ,极差 R 值大小显示因素作用主次分别为 CDBA; 即提取温度 C 的极差值最大 ,表明提取温度是影响超声波萃取的最重要因素。方差分析结果( 表 4)表明，C、D 因素对防风中色原酮的提取影响达到极显著水平(P0.01)。B 因素对防风中色原
16、酮的提取影响达到显著水平(P 0.05)。其最适宜的提取工艺组合为 A2B2C3D3 ,即料液比为 130 ,超声时间 45 min ,超声温度 50 ,超声频率 90 kHz。2.4 验证实验根据以上所 选最佳工艺 A2B2C3D3 的条件 ,对防风样品中色原酮类成分的含量进行测定 ,结果总色原酮质量分数为1.089 4% ,1.092 7% ,1.093 8% ,平均值为 1.092% ,大于正交设计中的含量 ,所得结果正确 ,并且具有良好的重复性和较高的准确率 ,所筛选的提取工艺条件基本稳定 ,可作为防风中色原酮化合物的测定方法。表 2 提取工艺正交设计实验结果（略）表 3 极差分析（略
17、）表 4 方差分析（略）3 讨论实验曾使用不同浓度的乙醇进行提取 ,但水溶性杂质也一起萃取出来 ,干扰了 4 种色原酮的 HPLC 检测 ,而用甲醇提取时水溶性杂质少 ,故本实验选用甲醇作为提取溶剂。实验结果表明，提取温度和超声频率对提取效果有极显著的影响。分析原因认为适度增加温度有利于提高溶剂的溶解度，但温度过高导致溶剂挥发严重，杂质溶出增加；而高频率的超声波可产生强烈震动和空化效应，从而加速植物材料中有效成分的溶出。通过单因素和 L9 (34) 正交实验 ，确定防风 4 种色原酮超声波提取最佳工艺为：料液比为 130 ，超声时间 45 min，超声温度 50 ，超声频率 90 kHz，其结
18、果经验证实验确认条件可行。该法具有实验设备简单，操作方便，提取时间短，提取效率高等优点。作为中药提取新工艺，具有良好的应用前景和实际的指导意义。【参考文献】1 国家药典委员会. 中国药典，部S. 北京：化学工业出版社，2005: 102.2 张贵君， 张燕波，李 影. 我国生药防风近 10 年的研究概况J. 时 珍国药研究, 1997, 8(1): 73.3 王林丽，宋志勇. 防风的研究进展J. 中国药业, 2006, 15(10): 63.4 薛宝云，李 文，李 丽,等. 防风色原酮甙类成分的药理活性研究J . 中国中药杂志, 2000, 25(5): 297.5 张晓东，潘国凤， 吕圭源. 超声提取在中药化学成分提取中的应用研究进展J. 时珍国医国药, 2004, 15(12): 861.6 姚仲青，李文林，周 俊，等. 防风提取工艺的研究J. 中国中医药科技，2007，14(6): 431.7 孙 晖，曹 玲，王喜军. 防风药效物质基础季节积累规律的研究J . 中国中医药科技, 2003, 10(6): 355.
