1、超临界二氧化碳萃取工艺对蛇床子素提取率的影响研究作者：宫竹云， 张高勇， 聂永亮， 谷惠先 【关键词】 超临界二氧化碳萃取；,蛇床子素；,提取率；,二次回归连贯设计摘要：目的对五因素间的交互作用进行考察，确定超临界 CO2萃取的最佳工艺参数。方法采用二次回归连贯设计的方法。结果 P 萃与 T 分 之间的交互作用较为明显，T 分与 T 分之间的交互作用次之，T 萃与 T 分、T 萃与 P 分，P 分 与 T 分之间的交互作用对蛇床子素提取率有一定影响。优化的工艺条件为：萃取压力为40 MPa，萃取温度 40；分离温度 45；分离压力为 5 MPa，分离温度为 46；CO2 流量为 18 L/h，
2、萃取时间为 80 min，在此条件下，蛇床子素提取率可达 4.32%。结论采用二次回 归连贯设计可以客观地反应各因素对目标函数的影响规律。关键词：超临界二氧化碳萃取； 蛇床子素； 提取率； 二次回归连贯设计蛇床子系伞形科蛇床属植物蛇床 Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果实。中药蛇床子的化学成分比较复杂，除挥发油外，主要为蛇床子总香豆素（Total coumarins of Fructus Cnidii ,TCFC）。TCFC主要以蛇床子素（osthol）和欧前胡素（inperatorin）为主，目前已知的蛇床子提取物的化学成分可达 40 多种。蛇床子味辛苦，性温，
3、具有散寒、祛风、杀虫等功能。用于湿痹腰痛、阴痒 带下等。有关蛇床子的超临界 CO2 萃取工艺，日本学者宫地洋1对台湾产蛇床子进行过初步研究，以中国大陆部分产地的蛇床子为研究对象，广州市医药工业研究所的葛发欢等对其挥发性成分2和有效成分的萃取3进行过初探，山西省中医研究院的王永辉等4进行了萃取压力、萃取时间及 CO2流量三因素对蛇床子素含量影响的研究。然而，影响超临界 CO2 萃取的工艺参数较多，且工艺参数间往往存在交互作用，为此，本文针对超临界 CO2 萃取全过程采用二次回归连贯设计法对五因素及其交互作用进行研究，确定了各因素及其交互作用对蛇床子素提取率的影响规律，从而得出回归方程，由此得出最
4、佳工艺参数。1 材料与仪器材料：蛇床子购自江苏省姜堰市药材公司，经山西省中医学院中药鉴定室裴香萍、牛燕珍老师鉴定系伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss 的干燥成熟果实。将蛇床子粉碎至 120 目备用。CO2 ：太原天 计应用化工有限公司生产，食品级，纯度在 99%以上。蛇床子素的标准品购于中国药品生物制品检定所。实验装置：HA1215001C 型超临界萃取装置（采用一萃二分流程），由江苏省南通华安超临界萃取有限公司制造。DF20 型流水式中药粉碎机，由无锡中银机械制造有限公司制造。LC5500 型高效液相色谱仪，UV 检测器, 由北京市东西电子科技研究所制造。
5、ME2.1 型超声波清洗器，由美国Metter Electronics 公司制造。2 实验过程2.1 超临界 CO2 萃取基本流程如下：CO2 瓶制冷系统高压泵萃取釜分离釜分离釜（循环）。实验过程：称取 120 目蛇床子粉末 200 g 放入萃取釜中，对萃取釜、分离釜、分离釜、贮罐分别进行加热或冷却，当达到所选定的温度时开启 CO2 瓶，通过高压泵对系统进行加压，当系统压力达到所设定的压力时，开始循环萃取，保持恒温恒压，按照计算机设定的取料时间间隔为每 10 min取 1 次料，从分离釜和分离釜出料口中取料。2.2 蛇床子素含量的测定2.2.1 色谱分离条件色谱柱为 ODS（十八烷基硅烷）柱；
6、流动相为甲醇水（82）；流速为 1 ml/min；检测波长为 322 nm;柱温为 35，进样量 20 l。在上述色谱分离条件下，用外 标法测定蛇床子素的含量，其 HPLC 谱图见图 1。图 1 蛇床子素高效液相色谱图（略）2.2.2 线性关系考察 蛇床子素对照品采用归一化法对其纯度进行测定，结果为 98%。精密称取蛇床子素对 照品 0.031 2 g，用 95%乙醇溶解并定容至 100 ml，得 0.312 mg/ml 的蛇床子素对照品溶液。分别量取上述蛇床子素对照品溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml 置于 6个 25 ml 容量瓶中，用 95%乙醇稀释至刻度，待测。
7、根据浓度(X)-峰面积（Y）进行线性回归，回归方程：Y=2 747.47+1.550107X，r=0.999 86 ，线性范围 6.2437.44 g。2.2.3 方法精密度 实验精密称取蛇床子提取物 5 份，按本实验方法分别测定蛇床子素的含量，RSD 为 1.49%，表明方法精密度良好。2.2.4 加标回收率实验精密称取已知含量的蛇床子提取物样品，分别加入一定量的蛇床子素标准品，按本实验方法进行测定。结果：回收率为 99.09%101.86%.2.2.5 样品测定样品的前处理：用第 1 溶剂（石油醚：醋酸乙酯=8515）100 ml 润柱（柱子 为 100 ml 酸式滴定管，硅胶为粗孔 80
8、100目），取 1.0 g 蛇床子超临界 CO2 提取物，用 5 ml 醋酸乙酯溶解后，倒入润洗好的柱子内，再用第 1 溶剂 120 ml 润洗，最后用 100 ml95%乙醇洗脱，收集样品，将溶剂挥干后待测。 样品的测定：精密称取经过处理的蛇床子超临界 CO2 提取物 0.02 g 至 25 ml 容量瓶中，用 95%乙醇溶解并定容至刻度，再取 2.5 ml 稀释至 25 ml 容量瓶中，定容至刻度，待测。2.3 蛇床子素提取率的计算蛇床子素的 提取率（ %）=蛇床子提取物的质量提取物中蛇床子素的含量 药材的质量100%3 实验设计方案由于蛇床子素提取率受萃取釜、两个分离釜工艺条件的影响，我
9、们选择萃取压力、萃取温度、分离压力、分离温度、分离温度这五个因素,并依据经验确定分离的压力为 5MPa，CO2 流量为18L/h，通 过多次实验确定萃取时间为 80 min。本实验最开始采用一次回归正交设计，但由实验结果所得出的回归方程经检验： F 回=S回/V 回 SR/VR=10.56F0.05(15，4)=5.86，表明方程的置信度有 95% Flf=Slf/Vlf Se/Ve=4.50F0.25(1，3)=2.02，表明方程是失拟的。因此必须增加实验次数加大误差自由度并对各因素间的非线性关系进行考察。采用 L16(215)表进行二次回归连贯设计5，设：萃取压力（z1）、萃取温度（z2）
10、、分离压力（z3）、分离温度（z4）、分离温度（z5 ），各因素编码值如表 1。采用该法后，为简化计算，按文献5的要求，对各影响因素进行重新编码。表 1 因素编码（略）j。r 为待定参数，r=1.719(计算方法详见 4.1 中) 。z0j(0)代表零水平实验点；z2j(+1)， z1j(-1)代表一次回归正交 设计中各因素的最大值点和最小值点，z12j (+r)，z11j (-r)代表二次回归连贯设计（即一次回归正交设计中的最大值点 1 和最小值点-1 均扩大 r 倍）中各因素的最大值点和最小值点。4 结果与讨论4.1 结果实验结果见表 2。总的实验次数 N=mc+mr+m0, m0 为零水
11、平重复实验次数（2730 号实验）， mc=1 22p 正交实验次数（116 号实验），mr=2p 为考察非线性关系 实验次数（1726 号实验），p 为因素个数。对 xj2 列进行中心化处理5,6，即对表 2 中 xj2 列的第 i 次实验的因素编码（xij2）进行线性变换：xij1=xij2-1 NN i=1 xij2,其中 N i=1 xij2=mc+2r2=16+5.908=21.908， r2=Nmc-mc 2=2.954，r为待定参数。所以，xij1=xij2-0.730 。表 2 中 x1x5 列中的 1，1，r，-r，0 分别代表表 1 中各因素在 z2j（+1），z1j（1）
12、，z2j 1(+r)，z11j (r)，z0j (0)时所 对应 的数值。 x1x2x4x5 列中的数值为每个因素分别取1，1，r，r，0 值时相应的乘积。 x11 x15 列表示将各因素分别取1，1，r,r,0 时代入到 xij2 线性变换式中所得的 值。表 2 实验设计方案与结果（略）表中 yi 为蛇床子素的提取率4.2 方差分析与 试验结果讨论根据表 2 的实验结果，作方差分析，结果见表 3。表 3 显著性分析（略） Se=m0 i0=1yi02-1 m0(m0 i0=1yi0)2=0.020,ve=m0-1=3,F0.01(1,3)=34.12,F0.05(1,3)=10.13,F0.
13、1(1,3)=5.54,F0.25(1,3)=2.02；式中 Dj (x0 除外)，x1x5 中的 Dj=16+2r2，x1x2x4x5 中的 Dj 为正交实验次数(16)，x1 x5中的 Dj =2r4，r=1.719,x0 中的 Dj 为总体实验次数：Bj=N i=1Xijyi,bj=Bj Dj ,Sj =bjBj,Fj=Sj/Vj Se/Ve 由表 3可知：在实验研究范围内，对蛇床子素提取率影响较为显著的是萃取压力（z1）与分离 温度（ z4）的交互作用；次 为显著的是：分离温度(z5)、分离温度（z4 ）与分离 温度(z5) 的交互作用、萃取压力（z1）；有一定影响的是：萃取温度（z2
14、）与分离温度（z4 ）的交互作用、萃取温度（z2）与分离 压力（ z3）的交互作用、分离 压力（z3）与分离温度（z5）的交互作用。回归方程：蛇床子素的提取率（% ）=3.70+0.10x1-0.042x2+0.058x3+0.12x5+0.055x1x2-0.05x1x3-0.20x1x4-0.095x2x3+0.096x2x4-0.041x2x5+0.041x3x4-0.091x3x5-0.13x4x5-0.046x2-0.077x3-0.043x4+0.050x5 （1）将表 1 中的各因素编码公式及 xj2 列中心化处理公式代入方程（1）中，整理得回归方程，如下：蛇床子素的提取率（%）
15、=-7.13+0.102 5z1+0.034 55z2+0.344 2z3+0.187 6z4+0.043z5+0.000 55z1z2-0.001z1z3-0.002z1z4 -0.001 9z2z3+0.000 96z2z4-0.001 025z2z5+0.000 82z3z4-0.004 55z3z5-0.003 25z4z5-0.000 46z22-0.003 08z32-0.000 43z42+0.003 125z52 （2）做回归方程(2)的显著性检验， F 回=S 回/V 回 SR/VR=11.80F0.01(20，9)=4.80，表明回归方程置信度是 99%， Flf=Slf/
16、Vlf Se/Ve=1.75F0.25(6，3)=2.42 表明方程拟合得很好,可认为是最优回归方程。综合考虑各因素之间的影响及交互作用，得到优化的工艺条件为：萃取压力 40MPa，萃取温度 40；分离压力10MPa，分离温度 45；分离温度 46。代入到回归方程中可得：蛇床子素提取率的 Y 值为 4.42%。为了更直观地表述各因素及其交互作用对目标函数的影响规律，我们将其中的三个因素固定为最佳值，在实验研究范围内根据回归方程考察其它两个因素，得图 211。从图中曲线不难看出，在实验研究范围内蛇床子素的提取率随 z2、z4的增加而递减（个别特殊的情形除外）；随 z1、z5 的增加而递增；从图中
17、可以看出 z3 对目标 函数的影响较为复杂，无一定的规律可循；除z1 与 z2、z1 与 z5、z3 与 z4 外各因素间均存在显著的交互作用。根据超临界 CO2 萃取的原理，z1、z3 通过改变 CO2 流体密度改变物质在其中的溶解度（压力增加溶解度增加）；z2、z4、z5 则通过改变 CO2 流体的密度和物质的蒸气压而改变物质的溶解度（温度升高，CO2 流体密度降低；物质的蒸气压增大。前者使物质的溶解度减少，后者使之增加）。各因素对目标函数的综合影响趋势最终取决于哪一方占主导优势。但溶质自身的性质是影响超临界 CO2 流体溶解能力最主要的因素。由于蛇床子素的提取率取决于蛇床子提取物的质量和
18、提取物中蛇床子素的含量这两个方面。因此，图中反映的规律应当是温度和压力对蛇床子提取物的质量和提取物中蛇床子素的含量这两个方面综合影响的体现。图 2 萃取压力、萃取温度与蛇床子素提取率关系图（略） 图 3 萃取压力、分离压力与蛇床子素提取率关系图（略） 图 4 萃取压力、分离温度与蛇床子素提取率关系图（略）图 5 萃取压力、分离温度与蛇床子素提取率关系图（略） 图 6 萃取温度、分离压力与蛇床子素提取率关系图（略） 图 7 萃取温度、分离温度与蛇床子素提取率关系图（略）图 8 萃取温度、分离温度与蛇床子素提取率关系图（略） 图 9 分离压力，分离温度与蛇床子素提取率关系图（略） 图 10 分离压
19、力，分离温度与蛇床子素提取率关系图（略）图 11 分离温度，分离温度与蛇床子素提取率关系图（略）采用超临界 CO2 萃取蛇床子中的蛇床子素等生物活性组分，当分离釜和分离釜的压力相同时，均从分离釜中出料，而分离釜中无收集物。保持分离釜的压力为 5MPa，在一定范围内变化分离釜的压力时，大约 90%以上的提取物仍然从分离釜 中出料。从实验结果看，第 1 个 10 min 内提取物的出料量约占总出料量的50%，以后出料量随时间的延长逐渐减少。4.3 回归方程的预测范围在上述优化的工艺条件下，Y 值的预测区间可以利用 35规则来确定。因为 =0.42,所以，在优化的工艺条件下，其指标真值在 4.420
20、.42 之间，即 4.00 到 4.84 之间，此时置信度为 99%。4.4 验证实验 依照最优的工艺条件，进行验证实验见表4。结果与回归方程预测结果基本接近，表明该工艺稳定可行。参考文献：1 宫地洋，山本秀 树.超临界萃取生药成分的研究J.药学杂志（日），1987,107（5）：367.2 王海波，葛发欢，李 菁，等. 超临界 CO2 萃取蛇床子挥发性成分的研究J.中药材，1996,19（2）：84.3 葛发欢，李 菁，黄晓芬，等. 超临界 CO2 萃取蛇床子有效成分的工艺研究J.中药材，2001,24（8）：570.4 王永辉，张 荣，李艳彦，等.蛇床子超临界萃取工艺的正交设计试验研究J.山西中医，2005， 21（3）：51.5 任露泉.试验优化技术，第 1 版M.北京：机械工业出版社，1987：121，243.6 上海师范数学大学数学系概率统计教研组编.回归分析及其试验设计，第 1 版M.上海：上海教育出版社，1978：162.
