1、高效液相色谱串联质谱法测定猪作者:刘勇军,吴银良姜艳彬沈建忠【摘要】建立了高效液相色谱串联质谱(hplcms/ms)测定猪肉样品中新型兽药泰拉霉素残留的方法。样品用v(甲醇)v(0.1%h3po4)=7030混合溶液提取，经离心后用pcx固相萃取小柱净化,以symmetryc8色谱柱为分离柱,url=护理论文发表/url，在串联质谱多反应监测(mrm)模式下检测，内标法定量。方法的线性范围为10500g/kg，检出限为5.0g/kg，在3个浓度水平(10，20和50g/kg)进行添加实验，平均回收率为93.1%105.5%;批内相对标准偏差为1.5%4.6%;批间相对标准偏差为1.8%5.6%
2、。【关键词】高效液相色谱串联质谱，猪肉，泰拉霉素，残留1引言泰拉霉素(tulathromycin)是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为c41h79n3o12(分子量806)，其分子结构如图1所示。我国农业部在2008年第957号公告中首次批准使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留、动物专用等优点1,2。我国广泛使用的大环内酯类药物为泰乐菌素和替米考星，虽然这两种药物的使用效果良好，但随着使用时间的延长，图1泰拉霉素分子结构式fig.1structureoftulathromycin在很
3、多地区出现了不同程度的耐药性3，而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物，因此，泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药，泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前，大环内酯类药物残留检测方法有elisa筛选法4、薄层色谱法5、气质联用法6、高效液相色谱710和高效液相色谱串联质谱法等11，12。有关泰拉霉素的残留检测研究较少13。本研究建立了以罗红霉素(c41h76n2o15,837)为内标的泰拉霉素的hplcms/ms检测方法，方法的定量限为10g/kg，可以满足有关法规对大环内酯类药物的检测要求，为动物组织中泰拉霉素的残留监控提供技术支持。2实验
4、部分2.1仪器与试剂waters2695quattromicrotmapi高效液相色谱串联质谱仪(美国waters公司);固相萃取仪(美国supelco公司);pcx固相萃取柱(3ml,60mg，agela公司);t25b组织匀浆机(德国ika公司);re120旋转蒸发仪(瑞士buchi公司);ms1minishaker旋涡混合器;eevap水浴氮气吹干仪(美国organomation公司);超纯水器(美国milliq公司)。泰拉霉素标准品与罗红霉素内标(sigma公司)、乙腈、甲醇、h3po4为色谱纯;甲酸、kh2po4、nh3h2o为分析纯;实验室用水为milliq高纯水。2.2标准溶液的
5、配制泰拉霉素标准储备液:准确称取泰拉霉素10.0mg，用v(0.05mol/lk2hpo4)v(乙腈)=7525(ph6.0)定容至10ml，摇匀，置冰箱冷藏储存，有效期3个月。内标物罗红霉素的配制方法同泰拉霉素。添加溶液的配制:吸取储备液1ml于100ml容量瓶中并用v(0.05mol/lk2hpo4)v(乙腈)=7525(ph6.0)混合液定容，再从中吸取1ml于50ml容量瓶中得添加液浓度为0.2mg/l(冰箱冷藏储存，有效期2个月)。2.3内标物质的确定由于大环内酯类药物的同位素内标物质很少,至今无泰拉霉素同位素内标物出售。而测定大环内酯类药物的检测方法研究和标准修制订一般采用外标法或
6、者采用大环内酯类某种结构相似药物作为内标物来进行定量分析。本实验选用一种没有用于兽药用途且结构与泰拉霉素非常相似的大环内酯类药物罗红霉素作为内标,分子结构如图2所示。图2内标物罗红霉素分子结构式fig.2structureofroxithromycinasinternalstandard2.4供试样品溶液的制备称取2.0g组织样品于50ml聚四氟乙烯塑料管中，加入10ml提取液(v(甲醇)v(0.1%h3po4)=7030)和适量内标工作液，7800r/min匀质1min后，5000r/min离心2min，收集上清液过已经分别用3ml甲醇和3ml提取液润洗过的60g/3l的pcx小柱，待全部过
7、柱后，再用3ml水、3ml甲醇淋洗，最后用4ml4%氨化甲醇洗脱，50水浴氮气吹干后用1ml流动相定容，进行hplcms/ms分析。2.5lcms/ms分析条件symmetryc8柱(20mm3.9mm，5m)，流动相:v(乙腈)v(0.1%甲酸水溶液)=7030;柱温:30，进样室温度15，进样量:10l，流速为0.3ml/min。esi(+);多级反应检测(mrm);毛细管电压:4.2kv;锥孔电压:20v;rf透镜电压:0.2v;离子源温度:110;脱溶剂气温度:350;锥孔气流速:50l/h;脱溶剂气流速:600l/h;倍增器电压:650v;二级碰撞气:氩气。3结果与讨论3.1样品的提
8、取和净化泰拉霉素含3个碱性的氨基基团，为弱碱性化合物，易溶于酸性溶液和极性溶剂中，在ph68的水溶液中较稳定,在酸性(ph4)和碱性(ph9)条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸不稳定性。据文献3报道,乙腈和甲醇是组织中大环内酯类药物常用的提取溶剂，且采用酸化的乙腈或甲醇为提取溶剂可促进大环内酯类抗生素从组织中溶出,改善提取效率。本实验比较了4种提取液:乙腈0.1%偏磷酸(7030,v/v)、甲醇0.1%偏磷酸(7030,v/v)、乙腈0.1%磷酸(7030,v/v)和甲醇0.1%磷酸(7030,v/v)对泰拉霉素的提取效果。结果表明，甲醇0.1%磷
9、酸(7030,v/v)提取液对泰拉霉素的提取效果较好，回收率高于其它提取液，故本实验选择甲醇0.1%磷酸(7030)为样品提取液。液液分配(lle)和固相萃取(spe)是大环内酯类药物的两种主要净化手段。液液分配操作比较麻烦且回收率相对较低，重复性较差，所以本研究采用固相萃取技术净化。比较了c18、oasismcx和pcx3种spe净化小柱,由于oasismcx小柱和pcx小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制，基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性，oasismcx小柱和pcx小柱的净化效果优于c18小柱。oasismcx小柱和pcx小柱提取效率没有明显差别，但pcx小柱成本低，所以，本方法选择pcx小柱。相关的主题文章:url=酚妥拉明治疗肺心病顽固性心衰40例疗效观察/url
