1、耐吉非替尼的肺癌细胞株的建立及其耐药机制研究摘要目的：探讨耐吉非替尼的肺癌细胞珠的建立及其耐药机制研究。方法：本次研究取吉非替尼加入到人肺癌细胞系 PC9 培养条件中培养直至耐药情况产生，回顾相关特点及耐药机制。结果：应用 0.5molL-1 吉非替尼向普通 PC9 细胞的培养基中持续加入，行 3 个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行 72h 处理，在 5molL-1 下具体 PC9-IR 对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在 0.5molL-1 时，显著抑制了敏感 PC9 细胞生长。耐药细胞 0
2、.5molL-1 生长率为 98%，敏感细胞为 35%，差异有统计学意义（P30 个细胞行一个克隆。行蛋白质印迹检测，用NP-40lysis buffer 制备蛋白样品，冰上行 10min 裂解后于温度为 4。 C 下行 10min 离心，蛋白浓度采用 BCA 法测定，制备 10%的 SDS-PAGE 凝胶并点样。孵育后行电化学发光检测，并应 CELL 成像仪对图像进行获取。分离并培养外周血单个核细胞（PBMNCs） 。具体方法为 5ml 健康志愿者（对照组）的肝素化静脉血，离心，用 60%密度将得到的细胞于培养板上种植，并用培养机完成培养操作。13 统计学分析 统计学软件采用 SPSS13.
3、0 版，计量资料行 t 检验，计数资料行 X2 检验，P0.05 差异有统计学意义。2 结果应用 0.5molL-1 吉非替尼向普通 PC9 细胞的培养基中持续加入，行 3 个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行 72h 处理，在 5molL-1 下具体 PC9-IR 对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在 0.5molL-1 时，显著抑制了敏感 PC9 细胞生长。耐药细胞 0.5molL-1 生长率为 98%，敏感细胞为 35%，差异有统计学意义（P0.05）。异鼠李素对 PBMNCs 细胞和 PC
4、9 细胞增殖作用显示，100molL-1 浓度下第 1d 的生长率为 39%，远低于 5molL-1 第 1d 86%的生长率，差异有统计学意义（P0.05 ）。于 6 个孔板中接种PC9-IR，每孔存在 100 个细胞，健康志愿者培养应用正常培养基，试验组选择异鼠李素 40molL-1加入，培养 10d，共重复 3 次，可见异鼠李素明显抑制 PC9-IR 细胞的克隆形成能力，有明显差异性（P0.05）。见表 1。表 1 两组 PC9-IR 细胞克隆数比较 （xs，个）组别 细胞数 克隆数实验组 600 6.013.43*对照组 600 30.175.75t - -4.176P 0.053 讨
5、论依据本次试验显示，先制成耐吉非替尼相关的人肺癌细胞株（PC9-IR），完成后再行异鼠李素完成后续处理操作 3。结果显示，结果显示，采用异鼠李素时可显著抑制 PC9-IR细胞生长，异鼠李素有较小细胞毒性。以往有研究表明，肿瘤细胞的生长信号通路可被异鼠李素明显抑制，且对 PI3K-Akt 的途径造成影响，故应 用 Western blot 法无成各项检测操作，在具体药物浓度为 40mol/LL-1时，在 PC9-IR 细胞中相关 AKt473 位的磷酸化水平已被明显抑制，表明异鼠李素可对 PI3K 产生影响的情况下对肿瘤细胞的生长起到抑制效果。40mol/LL -1 浓度在持续 10d 作用后，
6、明显抑制了 PC9-IR 的克隆形成能力 4。细胞生长中 PI3K-AKt 信号通路作用显著，可对细胞的应激反应、糖代谢及相关细胞周期产生影响。肿瘤细胞中 PI3K 信号通路被过度激活，故肿瘤治疗中此通路为重要靶点，众多研究显示，肿瘤细胞的 PI3K-AKt 通路采用黄酮类药物治疗可被抑制，将细胞于 C2/M期阻滞，进而抑制肿瘤生长。ECFR 参与介导的 PI3K、MAPK 等信号通路的激活在肺癌细胞生长中发挥着重要作用，吉非替尼对 EGFR 进行抑制进而起到显著的治疗肺癌的效果，但 EGFR 随即的突变，降低了药物的疗效，EGFR 突变后生长信号向下游的 PI3K-AKt 通路传递，造成继发
7、性耐药 5。应用 PI3K 抑制剂对吉非替尼耐药的肺癌可发挥治疗作用，而异鼠李素即为 PI3K 抑制剂的一种。结合本次研究结果显示，与上述观点符合。且癌细胞的生长依赖 MAPK、PL3K 等信号通路的激活，PI3K 途径在下游通路中作用显著，吉非替尼对 EGFR 抑制治疗肺癌作用明显，但 EGFR 突变时，易使吉非替层失去作用，变突的EGFR 将生长信号向下 PI3K-Akt 通路传递，出现继发性耐药。综上，通过建立耐吉非替尼的肺癌细胞株，对其耐药机制进行分析，并选择 PI3K-AKt类药物治疗，可显著改善预后，提高患者生存质量。参考文献：1 倪虹，杨茂，邹朝辉，等.新型小分子药物特异性抑制吉
8、非替尼原发耐药肺癌的体内实验研究J. 中国肿瘤杂志， 2011，38（10）：553-555.2 Mok T,Wu YL,Zhang L.A small step towards personalized medicine for non-small cell lung cancerJ.Discov Med,2009,8(43):227-231.3 王珊珊，刘明，刘英，等.MTT 法测定多柔比星和氟尿嘧啶及顺铂对肝癌耐药细胞 Bel-7402/ADM 的 IC50 值J.医药导报，2010，29（5）：579-581.4 Wei X,Guo W,Wu S,et al.Inhibiting JN
9、K dephosphorylation and induction of apoptosis by novel anticancer agent NSC-741909 in cancer cellsJ.J Biol Chem,2009,284(25):16948-16955.5 Yang Y,Zhou J,Zhou X,et al.Discovery of chrysoeriol,a P13K-AKT-mTOR pathway inhibitor with potent antitumor activity against human multiple myeloma cells in vitroJ.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2010,30(6):734-740.
