1、总第 26、27 节 课题 DNA 重组技术的基本工具教学目标知识目标、简述基础理论研究和技术进步催生了基因工程、简述基因工程的原理和技术能力目标1、 运用所学的 DNA 重组技术的知识，模拟制作重组 DNA 模型2、 运用基因工程的原理，提出解决某一实际问题的方案情感目标关注基因工程的发展教学媒体多媒体课件：展示基因工程的操作步骤教学重点DNA 重组技术所需要 3 种基本工具的作用教学难点基因工程载体需要具备的条件教学过程DNA 基因重组技术工具切割 DNA 的工具，“分子手术刀”限制酶；DNA 片段的连接工具，“分子缝合针”DNA 连接酶；基因转移工具，“分子运输车”基因进入受体细胞的载体
2、。下面我们就来学习这方面的内容。在进入对限制酶的学习时，你们可能最关心的是这种工具酶到哪里去寻找。例：一些生物的 DNA 可能进入另一种生物的细胞中。这种可能可用什么实例来说明？噬菌体侵染细菌的实验。现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源 DNA 的入侵而绝灭，仍能保持一种稳定状态呢？生物体有的有免疫系统，如动物；有的有保护作用的组织、器官，如植物。那么作为单细胞的生物来讲，怎么会有那么复杂的结构和系统？它如何来抵抗入侵的外源 DNA，保护自身呢？只有让外来的 DNA 失效，才能保护自身。那么怎样才能让 DNA 失效？DNA 酶用 DNA 酶，那么生物自身的 DNA 不也要失效了吗？
3、一种特殊的酶，能切割外来的 DNA，而对自身不切割。获得这种酶的意向？：到单细胞的生物中去找。单细胞生物比多细胞生物更容易受到外源 DNA 的侵入。在长期的进化过程中，使其必须有处理外源 DNA 的酶。科学家们经过不懈的努力，终于从原核生物中分离纯化出这种酶，叫做限制酶。迄今已从近 300 种微生物中分离出 4 000 种限制酶。这种酶与我们以前知道的 DNA 酶的作用是不同的。看书，学习限制酶特有的作用。特殊的酶有什么作用？它们能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。以上这句话，说出了两层意思。一是识别特定核苷酸序列。看图，E
4、coRI 只能识别 GAATTC 的核苷酸序列，SmaI 只识别 CCCGGG 的核苷酸序列。第二层意思是从特定部位的两个核苷酸之间切开。看图，EcoRI 就从 G 和 A 之间切开，SmaI 就从 C 和 G 之间切开。刚才我们提到科学家们已经分离出 4 000 多种限制酶。由于酶的不同，它们识别的特定核苷酸序列也不同，这样就为我们切割 DNA 提供了多种特定的“手术刀”。但它们切割 DNA 后形成的末端有两种可能。一种形成黏性末端，一种形成平末端。限制酶在它识别序列的中心位置两侧将 DNA 两条单链分割开，就形成黏性末端，而从识别序列的中心位置切开就产生平末端。切断的 DNA 片段要与受体
5、细胞的 DNA 连接，能用什么酶吗？用 DNA 复制中的 DNA 聚合酶吗？DNA 连接酶是将双链的 DNA 片段连接起来，而 DNA 聚合酶则是将一个个脱氧核苷酸连接起来。DNA 连接酶是将双链的 DNA 片段连接起来，就是说 DNA 连接酶是同时连接双链的切口，而 DNA 聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来。相同之处都是通过形成磷酸二酯键来连接的。限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接，Ecoli DNA 连接酶只能将双链 DNA 片段黏性末端之间连接起来，不能将双链 DNA 片段平末端之间连接起来。 T4 DNA 连接酶既可“缝合”双
6、链黏性末端， 也可“缝合”双链 DNA 的平末端， 但平末端之间连接的效率比较低。单纯的 DNA 片段是很难导入受体细胞的，所以我们将切割下来的目的基因导入受体细胞就需要有一个“分子运输车”帮助。不是任何的“分子运输车”都可以用来作目的基因进入受体细胞的载体的。其中的理由要从实际情况出发考虑才能清楚。1.假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？2.作为载体没有切割位点将怎样？3.目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？4.如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？1.导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。2.载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。3.如果载体上有遗传标
7、记基因，这样，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。4.载体对受体有害，将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。1. 能自我复制；2. 有切割位点；3. 有遗传标记基因；4. 对受体细胞无害、易分离。通常利用的载体是“质粒”。质粒寄宿在细菌细胞内的小型的环状 DNA。找到“复制原点”说明质粒能复制并能带着插入的目的基因一起复制。找到“目的基因的插入位点”说明质粒有切割位点。找到“氨苄青霉素抗性基因”说明有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。找到此质粒来自大肠杆菌说明没有危害，大肠杆菌是非致病菌，大肠杆菌分
8、裂快，也便于从大量复制个体中分离出来。总第 28、29 节 课题 1.2 基因工程的基本操作程序教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤教学难点（1）从基因文库中获取目的基因。（2）利用 PCR 技术扩增目的基因教学目标知识目标 简述基因工程原理及基本操作程序。能力目标 尝试设计某一转基因生物的研制过程。情感目标 关注基因工程的发展1为什么要有“目的基因的获取”这一步？引导学生看本专题题图中基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”可以说这既是概念，也是原理。这里所
9、说的“更符合人们需要”，就是目的，那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。2为什么要有“表达载体的构建”这一步？单独的 DNA 片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。3.为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。4.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？因为目的基因是否真正插入受体细胞的 DNA 中，是否能够在受体细胞中稳定遗
10、传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。一、目的基因的获取 推测出由 mRNA 反转录形成 cDNA 的过程大致步骤RNA 病毒中含有一种能将 RNA 转录成 DNA 的酶，这种酶被称为依赖RNA 的 DNA 聚合酶，由于与中心法则中的从 DNA 到 RNA 的转录是反向的，所以称为反转录酶（reverse transcriptase）。反转录酶既可以利用 DNA 又可以利用 RNA 作为模板合成与之互补的 DNA 链。像其他 DNA 聚合酶一样，反转录酶也以 53方向合成 DNA 的过程（图 1-3）。图 1-3 由 mRNA 反转录形成 cDNAcDNA 合成过程是：第一步，反转录酶以
11、RNA 为模板合成一条与 RNA 互补的 DNA 单链，形成 RNA-DNA 杂交分子。第二步，核酸酶 H 使 RNA-DNA 杂交分子中的 RNA 链降解，使之变成单链的 DNA。第三步，以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下合成另一条互补的 DNA 链，形成双链 DNA 分子。1.PCR 的扩增过程是怎样的？PCR 扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR 的扩增反应过程包括以下几个主要过程。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的 DNA 聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至 9095 ，使双链 D
12、NA 模板两条链之间的氢键打开，变成单链 DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至 5560 ，使两种引物分别与模板 DNA链 3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至 7075 ，在耐高温的 DNA 聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的 3-OH 上，使DNA 链延伸，产生一条与模板链互补的 DNA 链。上述三步反应完成后，一个 DNA 分子就变成了两个 DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n 的形式增加。PCR 的反应过程都是在PCR 扩增仪中完成的。2.如何从基因文库中找到所需要的基因？从基因文库中找到目
13、的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。第一步，通过 PCR 方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的 DNA 片段作为探针，与扩增出来的DNA 杂交。第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使 DNA固定在膜上。第三步，按 Southern 杂交的方法进行杂交。第四步，在 X 光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（
14、若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。第五步，从该菌落中再提取目的基因。二、基因表达载体的构建核心1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达；如通过 cDNA 文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（2）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （3）目的基因是否导入受体生物中需要有
15、筛选标记；（4）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。2.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？主要考虑以下几方面的因素。（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的 cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择
16、强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。基因表达 启动子：位于基因首端，RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动转录基因载体的组成 终止子：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因3方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用 DNA 连接酶把两者连接。目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）4条件：同种限制酶、DNA 连接酶、ATP（目的基因、启动子、终止
17、子、标记基因）三将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 导入植物细胞：农杆菌转化法（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）将目的基因导入受体细胞： 细菌氯化钙细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制导入动物细胞：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）导入微生物细胞：Ca 2 处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。提示：农杆菌转化法的原理是利用农杆菌（胞内寄生菌）对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。四目的基因的检测和鉴定检测是否插入目的基因，利用 DNA 分子杂交技术，目的基因 DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的 DNA 杂交，看是否有杂交带。检测是否转录出了 mRNA，利用 DNA 分子杂交技术，目的基因 DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的 mRNA 杂交，看是否有杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：DNA 分子杂交技术首先提取受体细胞中的 DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的 DNA 探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
