1、 t-PA 基因的 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、 实验目的1、掌握 PCR 反应的原理和方法；2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 DNA 的原理和方法。二、实验原理PCR 原理：首先使双链 DNA 在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链 DNA 配对结合，再在中温下利用 TaqDNA 聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约 30 次后，所扩增的特定 DNA 序列的数量可增至 10000000 倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完
2、成一个循环，就基本上使目的 DNA 物增加一倍。变性（denaturation）：双链 DNA 在 9296变性成单链 DNA。退火（annealing）：引物在 45-72与模板的互补区域相结合。延伸（extension）：在 72条件下 DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3-OH 端，DNA链的延伸方向为 5-3。DNA 琼脂糖凝胶电泳原理：DNA 分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的 DNA 片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长 254nm 紫外光照射下，DNA 呈现
3、橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳所需 DNA 样品量仅为 0.5-0.1g，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg或更少的 DNA 即可检出。三、实验仪器超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70） 、冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。四、实验药品蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA 聚合酶、Pfu 酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH
4、2O、EB、EDTA、SDS、引物。五、实验内容本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。1、设计 PCR 反应系统根据 PCR 反应系统的组成和要求，设计 20L 或 50L 的反应体系，可以下表 1 提供的50L 的 PCR 反应体系为参考。表 1 PCR 反应体系组分 原液浓度加量（L ）终浓度Buffer 10 5 1dNTP 10mmol/L 1 0.2mmol/L引物 1 5mol/L 1 0.1mol/L引物 2 5mol/L 1 0.1mol/LTaq 酶 5U/L 0.2 0.2 U/L模板 DNA 0.218mg/L 1 4.36g/LMgCl2 7DdH2O 33.8总体
5、积 502、进行 PCR 反应PCR 反应过程学生自行设计，可参考下列提供的 PCR 反应条件：94，5 min（热启动） ；94，1min（变性） ；52，1min（退火）721.5min（延伸） ；循环 30 次；72，10min；保温湿度；4。3、对 PCR 反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定将 PCR 反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的 1TAE 或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。2）溶液冷至 60时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为 0.5g/mL（也可以在电泳之后再进行染色。 ） 。3）
6、琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为 0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。4）室温下放置 30-45min 后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面 1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。6）在 DNA 样品中加入 16 的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择 l5Vcm。8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加 EB 的凝胶需要在含有 EB 的缓冲液中浸泡约 2025min。9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。t-PA 是组织型纤溶酶原激活剂，由 527 个氨基酸组成。t-PA cDNA 大小约 16kb。六、实验结果的讨论1、PCR 反应的原理是什么？影响 PCR 反应的主要因素是什么？2、琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理是什么？如何选择琼脂糖凝胶的浓度？EB 的作用是什么？
