1、HPLC 色谱柱十大神话神话一: HPLC 色谱柱不能反转使用错误！实际上 HPLC 色谱柱的填装压力比最大使用压力高很多（通常会高 2 倍）。如果装柱时使用了恰当的匀浆剂，并且分配一定的时间使柱床稳定，一支填装良好的色谱柱是完全可以双向使用的。需要反向使用色谱柱的情况包括：柱转换时的反冲、柱头被强保留物质吸附污染的色谱柱清洗（反冲的冲洗路径更短更合理）、冲洗残留在筛板上的颗粒物以降低柱压或防止柱压升高。反向使用色谱柱有一个例外，就是生产商在色谱柱的进样端使用了孔径更大筛板的情况， 反向使用可能会将填料从柱床冲出。色谱柱在工厂填装时，出口端的筛板孔径必须比色谱柱中最小颗粒的粒径还要小。譬如，色
2、谱填料平均粒径是 5m，粒径分布范围是 37 m, 出口端筛板孔径必须小于 3m ，使填料没有可能从柱床跑到色谱柱筛板外面。大多数生产厂家选择的筛板孔径是 2m。 为什么有些色谱柱生产厂家会选择入口端和出口端采用不同孔径的筛板呢？很简单，孔径大的筛板相对孔径小的筛板不容易堵，一个 0.5m 的筛板会比一个 2m 的筛板被堵得快。所以为了避免柱压上升过快和客户的抱怨，生产商会折中地选择在入口端用一个孔径稍大的筛板，通常色谱柱上就会标一个箭头表示只能在一个方向使用。在反向使用 HPLC 色谱柱时，最好仔细看一下说明书或者咨询一下色谱柱生产厂家是否能反向使用。神话二：所有的 C18（L1）柱是一样的
3、。 错误！ 在 HPLC 发展初期，十八烷基硅烷（常被称为 ODS 或 C18）是最早的键合固定相之一，也导致了“反相色谱”这个新技术的诞生。C18 成为了反相色谱的标准固定相并被大部分色谱工作者所采用。制药工业是 HPLC 技术的最早使用者，监管部门不想偏袒任何一家色谱柱生产厂商的品牌名字，FDA 和 USP 编写了一套分类体系，给每一种药物应用方面的新方法一个通用名称。对 HPLC色谱柱，命名为“L”，C18 因为出现在大部分送审材料中，理所当然就成为了“L1”。随着另外固定相的增加，分别都有了自己的“L”序列号（如：L7 是 C8，L10 是 CN 基，L11 是苯基等等）。很不幸，这个
4、命名体系被证明是不可靠的。因为每种商品化的 C18 色谱柱，虽然同样是选用硅胶作为基体，但各自都有自己特定的填料键合合成工艺，因此色谱性能也不相同。譬如，有的生产厂商采用十八烷基一氯硅烷键合试剂和低表面积的硅胶（见图一所示），而其它一些厂家采用同一硅烷试剂但选用了表面积更高的硅胶基体。这两种 C18 柱表现的色谱性能不同，后者 C18 固定相的键合比例大于前者。较低的固定相键合比率，表面未反应的硅醇基较多，有时混合保留机理起主要作用。某些色谱柱生产商使用二氯硅烷和三氯硅烷作键合试剂，将键合相聚合反应形成一很厚的具有不同扩散特性的疏水层。为使键合后硅胶表面未反应的硅醇基比例降低，有些生产商用小分
5、子的硅烷试剂（如三甲基氯硅烷）封尾。硅醇基是在中性条件下测定碱性物质时导致色谱峰拖尾的原因之一，有些生产厂家，更进一步的做法是采用第二种小分子硅烷进行双封尾工艺，以提供一个更加惰性（疏水性）的硅胶表面。另外有些生产商采用聚合物基体材料进行 C18 键合，生产出一种完全不同的 C18 填料，但仍然被归类到“L1” 。还有厂家采用反应性能不同的硅烷化试剂 organoalkoxysilanes，制造出一种与氯硅烷反应产生的不同的 C18 固定相。神话三：保护柱不影响分离效果错误！首先，配一个保护柱是个好主意。如果保护柱的式样或固定相选择错误，保护柱也能够对分离效果有很大影响。要明确的是：保护柱是保
6、护分析柱避免强保留的组分、颗粒物和其它一些不需要的东西污染用的。保护柱比起分析柱便宜许多，所以污染的保护柱能够替换的更加勤。理想的情况是，保护柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留强（如高载碳量和混合相） ，就能够使得保留时间漂移，甚至导致不同的选择性。如果保留弱，问题就不那么明显，除非固定相影响整个体系选择性。为了使保护柱最小化的影响分离，保护柱需要合适的装配。显然，保护柱安插在进样口和分析柱之间，但是如果管路太长（太长或者内径太大） ，就会造成额外的峰展宽，从而影响分离。系统引入整合保护柱（保护柱直接接在色谱柱上） ，从以往的报道看，基本上会达到分析柱的最佳水平。但是，整合保护柱通常和
7、卡式色谱柱一起使用，目前已不是那么流行。不管采用什么形式的保护柱，都应当在不影响操作的前提下容易从 HPLC 系统中卸下和更换。理论上，接上保护柱延长了分析柱的柱长，会增加柱效和色谱分离效果。但由于上面讨论中的一些因素的影响，增加保护柱只能维持原来的色谱分离性能在最佳水平，有时候甚至会变差。使用保护柱的好处是延长柱寿命，而非提高整体色谱分离效果。神话四：提高温度往往有利于分离效果错误! 随着温度升高，流动相粘度下降，因此分析物传质速率提高，所以就能够提供更好的色谱分离效果。正确，但是除了柱效，温度同样影响保留因子（k）和选择性（） 。温度的变化因素能够提高或降低分辨率（其实这也是色谱分析最关心
8、的问题） 。保留时间往往随着温度升高而降低，因为温度作为一个热力学参数，使得高温度下分析物倾向于留在流动相中，会更快的从柱子上洗脱下来。然后，不同的化合物可能对温度变化有不同响应程度的保留时间改变。更加确切的说，它们的范德霍夫线的斜率不同（ln k 与 1/T，T 以绝对温度计量） ；换句话说， 值会变化。另外温度增加会使低 k 值的色谱峰出峰更快,甚至接近在无保留物质 t0 附近出来,导致很难进行定量分析。以 analgesics(一种镇痛药，译者注)为例，图二显示的一系列的色谱图列出了七种镇痛药在柱温 20-90C 的分离情况。我们从中可以发现许多特点。首先，所有分析物随着温度升高，保留时
9、间变短且峰变窄，意味温度升高利于分离效果。其次，镇痛药之一的水杨酸（即阿司匹林）在峰 5，6 之间，随着温度变化位置改变较大。事实是在 20-40C 时，该物质随温度变化，洗脱顺序也发生了变化。在中间的 30时，水杨酸和第 6 号峰的非那西丁一起出峰。所以，温度大于 40C 会引起分离时间变短和洗脱顺序发生变化。当然，一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压，以便于使用更大的流速和粒径更小的填料。另一个在高温下能够导致色谱柱性能问题的因素是流动相的温差。如果柱子在 60C 下操作，但是流动相在室温流入，那么进入的较冷的流动相就能够引起峰变形，原因是不同温度下分析物会趋向在高温的流动相中。所以建
10、议大家在较高温度下使用色谱柱的时一定记得预热流动相。神话五：碳载量越高，反相色谱柱就越好错误！谈到普通的烷基键合相时，这样的结论看来是对链长、载碳量和表面键合度等概念有误解。通常，对一个真正的反相保留机制来说，保留能力取决于被分析分子的相对疏水性，所以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留能力越强。载碳量一般与链长成正比，但并不是必然如此。典型的色谱硅胶表面，可用于和有机硅烷试剂键合反应的硅醇含量在 8.0 mol/m2 左右。假设在所有的硅醇基上都能实现单层键合，则链长越长，载碳量就越大，结果是保留能力与链长成正比。然而，虽然是短链键合相（比如 C8） ，如果表面键合度相对更高，那么键合的碳
11、就会更多，就会导致可能比C18 有更加强的保留能力。此外，一些厂家使用二氯硅烷和三氯硅烷做键合试剂，由于聚合反应的发生通常能增加固定相的键合率。这种情况下，短链聚合键合相会比长链单体键合相的键合度高很多。对比单体键合相，聚合物键合相的键合层较厚，有时会引起传质速度变慢。高载碳量的反相柱更加容易发生相塌陷（或更确切地称固定相失湿） 。对于这些柱子，当流动相中有机相比例降到 10%以下的时候，类油的疏水固定相之间就会倾向于互相结合（self-associate） ，而不是处于在极性水溶液中的溶解状态（即相似相溶） 。所以，在此情况下，高碳载量反而可能对反相色谱性能有害，而且保留时间的重现性也不好。
12、神话六：小粒径色谱柱的柱效总是相对更高错误！对于一个装填良好的色谱柱而言，随着所装填的填料平均粒径的减小，柱效提高；但是对于某个特定的 HPLC 仪器，如果引起峰展宽的柱外效应足够大，小粒径色谱柱的高柱效就不能实现。柱外峰展宽效应由填料本身以外的所有额外的体积引起，它们包括：1. 进样体积，包括进样环以及进样阀内的额外体积2. 从进样阀（器）出口到色谱柱入口的管路体积3. 保护柱内的间隙体积（保护柱如果有柱头，还包括柱头内体积）4. 在线过滤器内体积5. 色谱柱入口到色谱填料之间的一段距离的体积，包括筛板孔隙和液流路径的体积6. 色谱柱内填料颗粒之间的间隙体积7. 色谱柱色谱填料到出口的一段距
13、离的体积，包括筛板孔隙和液流路径的体积8. 色谱柱出口到检测器入口的管路体积9. 检测器入口到流通池的管路体积10. 检测流通池体积上述均为柱外体积。因此，即便能够做到把进样量最小化，保持色谱柱入口前的管路尽可能短，内径尽可能小。但如果色谱柱出口到检测器的用了内径 0.2 英寸的管路有 1 米长，谱带展宽效应就可能会大到影响色谱分离的总体效果。所以，想要在小于 2m 粒径填料的色谱柱或者 1.0mm 内径的 微孔柱上得到期望的分离效率，就要确保把 HPLC 体系的柱外效应减到最小。神话七：对于硅胶填料，残留的硅醇基是造成拖尾的原因错误！在特定条件下，硅胶基质键合柱上存在的硅醇基，尤其是在分析碱
14、性物质时，能够造成峰拖尾。拖尾的原因在于硅醇基团本身就是一个弱酸，pKa 大约在 4.5 和 4.7 之间。因此如果流动相 pH值在 4 到 5 的时候，硅醇就会离子化，并与诸如质子化的胺类等带正电荷的分子通过静电引力发生作用。可以通过将 pH 降到 3 以下来抑制硅醇基的离子化的方式尽量减小该种作用。但是对于许多碱性化合物，在低 pH 条件下也能够发生拖尾。有经过特别设计的专门的反相色谱填料，对碱性化合物的测定，能获得好的峰形。三种原因能够造成拖尾，化学问题（之前已经讨论过部分） ，柱填充问题，色谱设备硬件问题。三种问题都可以造成拖尾，但是要解决问题，就需要找到问题的根源。详细探究这三种原因
15、超出了本文的范围，这里就三种类型的问题分别举几个实例，使大家有一个大概的认识。首先，除了硅醇基的作用外，化学因素的拖尾还有其它几种方式。与金属产生螯合作用的化合物与色谱填料中的痕量金属作用引起的拖尾，在早期的硅胶基质中特别明显。错误的进样溶剂选择能够导致拖尾，使用比流动相强的溶剂进样也能够导致峰变形失真。样品中不容易洗脱的强保留组分和流动相中的杂质在柱头的逐步累积也可导致拖尾，这些在柱头累积的物质能扮演不同的固定相角色，与经过的分析物作用而导致分析物峰形拖尾。有时，存在混合模式的保留作用也能够诱发拖尾，如分析物与活性基团既有反相作用也有离子相互作用的情况。有时候，流动相 pH 选择错误，样品部
16、分离子化，分子态和离子态共存，混合模式作用就能够导致峰扭曲和拖尾。此外，一个大的色谱峰后面如恰好有一个洗脱出峰时间相差不大的的小峰，看上去也和拖尾一样。柱子的填充质量不好也可以导致拖尾。柱头的填料空隙可以导致峰分叉或者拖尾。如果柱子没有填充好，柱床上有微小的沟槽就能够使峰形过宽。进样浓度过大，样品过载也会导致拖尾，样品过载导致峰前延的情况更常见。如果样品进得少了，因为过多的硅醇基存在，也能够导致拖尾。接下来来讨论下仪器硬件问题导致拖尾的情况。前面说的管路死体积（extracolume）和接头体积能够导致拖尾。进样时的瞬间加压可以造成柱头填料塌陷（有空洞形成）从而引起拖尾。反应比较慢的检测器用来
17、检测快速洗脱出的分析物时会形成峰展宽和拖尾（和流通池厚度，长度有关 译者注） 。前文中说的柱操作温度和流动相温度不一致也会引起拖尾。所以说，造成 HPLC 拖尾的不总是硅醇基。神话八：硅胶填料只能够在 pH2 到 7 使用错误！通常有两种 HPLC 反相柱的化学毁坏机理：在低于 pH2 时,硅氧键的催化水解；在 pH 大于 7或 8 的时候，硅胶被水中 OH-离子溶解。Kirkland 和其合作者对这两种机理做过详细的研究。pH 小于 2 的时候，-Si-O-Si-可以被水合氢离子 H3O+进攻，固定相就会流失断裂。随着时间的推移，随着载碳量下降保留值会慢慢下降。有三甲基氯硅烷等短链封端的色谱
18、柱，由于封端试剂更易水解流失，这种现象更为明显。长链 C18 固定相因为空间位阻效应，对于这样一种流失有一定的保护作用，但是最终仍然是慢慢被侵蚀，尤其是温度高于环境时。空间保护、高密度键合有助于防止硅胶键合相的流失。聚合固定相在这种条件下表现良好，但是比起硅胶固定相，其柱效要低。在高 pH 方面，一定需要有保护硅胶基体免于氢氧根离子进攻的措施。一旦溶解过程开始，随着柱床内空洞出现，色谱柱会最终失效。所以开发了双硅烷交联 C18（bidentate C18） 、有机无机杂化颗粒以及聚合物包覆硅胶等耐高 pH 的特种色谱柱。这些柱子都使用了化学方法来保护固定相避免OH-的攻击。上述的特种柱子能够承
19、受 pH11-12 的条件。在此碱性 pH 条件下，柱子要避免高温使用。当然，聚合物色谱柱能够在 pH13 甚至 14 的条件下使用，但是，前文已经指出，聚合物柱比硅胶柱柱效要差些。因此，在这个论点上，特殊的硅胶柱能够在 pH2-7 以外的范围使用，但是普通硅胶色谱柱要格外小心，由其是在高温条件下。神话九：当代 HPLC 柱至少应该承受 1000 次进样错误！现代 HPLC 色谱柱能够承受的进样数量由许多因素决定。有些因素基于以下色谱作用的模式不同而不同：反相色谱，离子交换色谱，排阻色谱，正相色谱，手性色谱，亲水交互色谱等等。有些因素基于不同的填料基体：硅胶基质，杂化基质，氧化锆基质，聚合物基
20、质，或者是凝胶和有一定交联度的聚合物树脂。有些因素基于固定相本身的一些特性：表面键合度，键合方式，聚合还是单层键合，或者是聚合物包覆。其他的因素和色谱应用条件有关：pH，温度，流动相组成，缓冲液组成，流动速率，压力等等。还有些和样品有关：完全标样，样品洁净度，样品 pH，样品体积（含量） ，样品杂质，分析物分子本身特性等。如果一根柱子被滥用，比如在 pH 范围外，或者流速范围外，很有可能连 50 次进样都成问题。如果样品里都没有强保留物质，5000 次使用也不为过。如果色谱柱不在其承受力上限上连续使用，寿命会更长。如果柱子进样的样品繁杂，但是从来不冲洗除去柱子里的强保留物质，寿命必然减少。通过
21、对许多制药公司访问得到的经验表明，绝大多数 5m 反向色谱柱在分析制剂、简单药品混合物，和标样的情况下能够承受至少 1000 次进样。如果样品“很脏” ，比如没有进行过严格完全净化生物样品提取物，环境样品提取物，1000 次进样是问题的。所以说柱子能够承受的次数不是绝对的，而是取决于柱子的类型，操作条件，样品洁净程度和柱子被滥用程度等。当然，使用保护柱或在线过滤器，柱子的寿命会延长。在很多个专业研讨会上，作者通过对听众非正式的投票调查，结果表明：只有不到 15%的使用者实际记录了某支特定色谱柱能够用的次数，很多色谱工作者并不真正知道每支色谱柱到底能够使用多少次进样。一些现代的HPLC 仪器的软件可以记录或监控进样的次数。神话十：色谱柱总是应该紧紧的密封，以防被填料因与空气接触而损坏错误！通常色谱柱两头的微孔的直径不到 0.2 英寸，所以在如此小的截面积的区域内，空气进入和填料接触以及色谱柱内溶剂蒸发所造成的损伤都十分微小。即使是有部分空气进入色谱柱，也很难扩散通过致密的填料床，接触足够多的填料而造成损害。假若柱子中有了部分空气，只要装在色谱设备上运行一次，在高压下会立即溶解，然后流出色谱柱，不会对后面的使用有任何危害。当然，如果你为了保险，死死的拧紧也行。大部分柱子都配备了带螺纹的柱塞头，手动就能够拧紧，以防止溶剂蒸发，空气进入填料。
