1、HBx 及其不同突变体对 Hippo 信号途径表达的影响陈琰琰 1朱慧芬 3杨道锋 4刘晓聪 1邓科兰 4黄春梅 3胡晓萌 4姜素华 23沈关心 3(832002 新疆维吾尔族自治区 石河子 石河子大学医学院：生物化学教研室 1，病原生物学与免疫学教研室 2；430030 湖北 武汉 华中科技大学同济医学院免疫系3 华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科 4）提要目的 初步探寻HBx及其不同突变体表达与Hippo信号途径的关系，以及对细胞凋亡的影响。方法：HBx及其突变体载体转染人正常肝细胞系L02，转染48h后，提取总蛋白，Western blot检测细胞中Hippo信号途径Mst1/2、
2、YAP(Yes-associated protein)的表达，磷酸化和去磷酸化的情况。采用Annexin V/PI 标记流式细胞术检测细胞凋亡。结果：HBx及其突变体载体转染L02细胞48h后，Western blot结果显示细胞MST1/2表达下调，P-MST1/2表达上升；YAP表达上升，P-YAP表达下调。Annexin V/PI 标记法流式细胞术结果显示HBx及其突变体能促进L02细胞发生凋亡，其介导的细胞早期凋亡尤为明显。结论：HBx通过hippo信号通路途径调控下游致癌基因YAP的表达。结合HBx介导的L02细胞凋亡这一结果说明HBx是一类多功能调节蛋白，可能通过多种途径调节细胞周
3、期。关键词：hippo YAP 乙型肝炎病毒 X 蛋白 乙型肝炎病毒 肝癌 细胞凋亡The effects of HBx and its mutant on Hippo signaling pathway and cell apoptosis in a human hepatic cell line1Chen Yanyan,3Zhu Huifen, 4Yang Daofeng, 1Liu Xiaocong,4Deng Kelan, 3Huang Chunmei, 4Hu Xiaomeng, 2Jiang Suhua,3 Shen Guanxin（ 1Department of Biochemi
4、cal and Molecular Biology， 2Department of Immunology，Medical College of Shihezi University;Shihezi,Xinjiang Uygur Autonomous Region,832003;3Department of Immunology， 4Department of infection ,TongjiHospital;Tongji Medical College; HUST; Wuhan;Hubei Province;430030）Abstract ObjectiveTo explore the re
5、lationship of HBx and its mutant to Hippo signaling pathway and the effects of HBx on cell cycle and apoptosis.Methods L02 cells were transfected with HBx and its mutant.After 48h of incubation,total protein was obtained and the expression levels as well as the phosphorylation status of Mst1/2 and Y
6、AP were detected by Western blot. The apoptosis of L02 cell was examined cytofluorometrically by Annexin V/PI staining. Results After transfection,the results of Western blot showed that the expression level of P-MST1/2 and YAP were up-regulated and the level of MST1/2 and P-YAP were down-regulated,
7、In the results of flow cytometry,more apoptosis cells were observed in experimental group compared with the control group,the trend is particularly apparent for early apoptosis. Conclusion HBx could regulate the expression of YAP through Hippo signaling pathway .Thismechanism may relevant to HBV rel
8、ated HCC,combined with the results of flow cytometry,and it suggested that HBx is a multifunctional protein that regulates the cell cycle in several ways.Key wordshippo YAP HCC HBV HBx apoptosisSupported by National Science and Technologysubprojects of 973 Program （2007Cb2906）Corresponding author: S
9、hen GuanxinE-mail: guanxin_ ；Jiang Suhua E-mail:_基金项目国家科技部 973 课题项目（2007Cb2906）通信作者沈关心E-mail: guanxin_ ；姜素华 E-mail:越来越多的研究表明，HBx是一种多功能蛋白，可通过反式激活机制调控细胞周期和信号转导，影响细胞周期，在乙型肝炎病毒相关疾病发生起重要作用。Hippo-YAP被认为是与肿瘤发生密切相关的一条信号通路。本研究初步探寻（hepatitis B virus X protein，HBx) 及其不同突变体表达与Hippo信号途径的关系，以及对细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1
10、主要试剂与材料人肝细胞系 L02（购自武汉大学） ，细胞转染试剂 Lipofectamine2000（购自美国 Invitrogen 公司） ，培养基 DMEM，胎牛血清（购自杭州四季青公司） ，HBx 野生型质粒载体 X0和 HBx 突变体 X17-3（由印度学者 Vijay Kumar 提供） 1，超级感受态细菌制备试剂盒（购自碧云天生物） ，质粒抽提试剂盒（购自康为世纪公司） ，细胞总蛋白提取试剂盒（购自碧云天生物）western blot 适用一抗 Mst1及磷酸化 Mst1/2（购自 abcam 公司） ，YAP 及磷酸化 YAP（购自美国 Cell Signaling 公司） ，H
11、RP 标记二抗（购自武汉博士德） ，超敏 ECL 化学发光即用型底物（购自武汉博士德） ，Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒 （购自北京庄盟国际生物公司） 。1.2 HBx 及其突变体质粒载体转染 L02细胞将 L02细胞铺到六孔板内，并加入含10%FBS 的 DMEM 培养基，待到板内细胞汇合度达到90%，即转染质粒到 L02细胞内，细胞分组情况为 X0组（转染 X0） 、X17-3组（转染 X17-3）和 control 组（只加入转染试剂） ，4h 后三组全部换含10%FBS 的 DMEM 继续培养。1.3 western blot 检测目的蛋白的表达提取转染48h 后的
12、细胞总蛋白，计算蛋白浓度后，每孔上样量50mg，10%分离胶电泳条件100V 到 Marker 条带跑开，转膜200mA，湿转1h，5%BSA 封闭过夜，随后按抗体说明书建议浓度孵育一抗二抗。最后滴加 ECL 显色剂曝光条带。1.4 Annexin V/PI 标记流式细胞术检测细胞增殖与凋亡转染后48h，用0.25%的不含 EDTA 的胰酶消化贴壁细胞，PBS 循环悬浮离心细胞两次，细胞计数后，以每管5*10 8左右的细胞量加到流式管中，按照 Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒说明书上的方法避光加入 Annexin V-FITC 和 PI，混匀，避光孵育15min，在1h 内运用流式细胞
13、仪检测细胞的增殖凋亡。1.5 统计学分析采用 Image-Pro Plus 分析 western blot 条带光密度，采用 SPSS10.0软件统计处理数据，运用双因素方差分析。2 结果2.1Hippo-YAP 通路各蛋白表达情况实验组较对照组 Mst1的表达下调，磷酸化 Mst1/2(P-Mst1/2)表达上调，统计学有差异（P0.05） 。Mst1和 Mst2是一种全长56KDa 或者34-36KDa 的多肽，后者这种被截短的氨基末端是在细胞凋亡过程中由于细胞凋亡蛋白介导的应答反应产生的 10。实验组较对照组 YAP 表达上调，磷酸化 YAP（P-YAP）表达下调，统计学有差异（P0.0
14、5） （图1、表2、表3、表4、表5） 。2.2 L02细胞的早期凋亡和晚期凋亡实验组和对照组在 Q2(早期凋亡)、Q4（晚期凋亡）象限均有反应，其原因可能与转染试剂 Lipofectamine2000对细胞的毒性相关。实验组较对照组在早期凋亡有明显的差异（P0.05） ，在晚期凋亡无明显差异（图2、表5、表6） 。图1表1* p0.05 when compare with control group表2* p0.05 when compare with control group表3* p0.05 when compare with control group表4* p0.05 when c
15、ompare with control group图2表5* p0.05 when compare with control group表63 讨论HBV 至少四个开放重叠的读码框：，和 X 区，研究发现基因表达的 HBx 蛋白在 HBV 相关性 HCC的发生发展中起到重要的作用 2-3。HBx 是一种多功能蛋白，能通过多种途径诱导 HCC 的发生，比如可通过反式激活转录作用干扰肝细胞 DNA 的修复作用，从而影响细胞增殖凋亡周期等 4。近年来的研究表明 HBx 能通过激活 Ras/Raf、Src、AP-1、-等途径来调节细胞的增殖与凋亡，代谢活跃度等 5-7。但是对于 HBx是否通过 Hip
16、po 途径影响 YAP 磷酸化水平，调节细胞周期与凋亡还未见报道。Hippo信号通路最早是在对果蝇研究中发现，通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡来影响器官的大小， Hippo信号途径亦可能与肿瘤发生发展的关系密切，引起关注，成为近年来的研究热点 8。Hippo信号通路在果蝇中主要由Hippo, Sav, Wts和Mats组成，在哺乳动物中，与之对应的信号分子分别是 Mst1/2, WW45, LATS1/2和Mob1。Hippo 通路中的4个核心成分构成 2个蛋白激酶复合物形成一个级联反应，Hippo/Mst与Sav/WW45相互作用，促进Wts/LATS和Mats/Mob1复合物发生磷酸化而活化
17、 9-13。近年研究认为在哺乳动物中YAP是一种癌基因，Hippo信号通路中磷酸化的LATS和Mob1复合物使转录因子YAP磷酸化，磷酸化后的YAP与14-3-3蛋白结合并在细胞质中滞留，使细胞产生接触抑制并控制器官大小。而未发生磷酸化的YAP即进入细胞核发生转录，使细胞增殖，不发生凋亡，形成肿瘤 14-16。本研究中运用的质粒载体由印度学者Vijay Kumar构建，X17-3是高表达HBx基因中N端A区域的突变体，在Vijay Kumar的研究中发现该类突变体抑制HBx所有报告基因的反式激活作用和基本活性，并且认为该区域具有负调节作用 1。本研究Western blot结果显示L02细胞内
18、Mst1/2在转染HBx野生型（X0）及HBx突变体(X17-3)后表达减弱，YAP表达加强，P-YAP表达下调。X17-3组和X0组相比无明显差别。提示HBx可能通过调控Hippo信号通路，进而YAP的表达加强。而HBx介导的Hippo-YAP通路的激活可能与HBx的反式激活作用无直接关联。近年来有研究表明，YAP的表达与HCC的发生发展预后都有密切相关系17-18。本实验流式细胞术结果表明，L02细胞在转染了HBx及其突变体后,L02细胞早期发生凋亡比对照组增多，X17-3组和X0组相比无明显差别。虽然各组均存在晚期凋亡，但无统计学差异。本实验结果证明Hippo-YAP通路表达差异对HBx
19、在HBV感染致病中的作用，而与肝癌发生发展的关系尚待进一步研究。HBx对于不同肝细胞系的影响不同，HBx可以通过下调L02细胞NF-B 蛋白的表达，而阻滞细胞周期进程，促进细胞凋亡 19。HBx诱导的细胞凋亡，也可能与不同阶段HBV感染和HBx的表达量有关 20。HBx还可通过线粒体途径和死亡受体途径诱导细胞凋亡 21。有研究认为，HBx诱导的细胞凋亡可促进肝再生和基因突变的积累，进而导致肝细胞转化和HCC的发生 22。由此表明，HBx无论是抑制细胞凋亡还是促进细胞凋亡，都可能导致肝细胞恶性转化，进而导致HBV相关性HCC的发生。HBx 是一种多功能蛋白，能通过多种途径诱导 HCC 的发生，并
20、且 HCC 的发生发展是一种多因素诱导，多步骤的复杂过程，因此，更多的机制还需要进一步研究。参考文献：1Misra KP, Mukherji A, Kumar V. The conserved amino-terminal region (amino acids 120) of thehepatitis B virus X protein showsatransrepression function J.Virus Res.2004 Oct;105(2):157-65.2Matsuda Y，Ichida T.Impact of hepatitis Bvirus Xprotein on the
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