1、 中国医学科学院学报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE miR29b通过靶向PDKAkt信号通路降低 胃癌细胞对顺铂的耐受性 陈点点 ，冯林春 ，叶 蕊 ，何玉琦。，王雅棣4 中国人民解放军总医院放射治疗科，北京100853 北京军区北戴河疗养院，河北秦皇岛066100 北京军区总医院 消化内科 放射治疗科，北京100700 通信作者：冯林春电话：010-66939296，传真：01084661080，电子邮件：15811155735163corn 论著 摘要：目的探讨miR一29b与胃癌细胞顺铂耐受性之间的关系及其可能的调控机制。方法采用实时定量PCR (qR
2、T-PCR)和Western blot法检测顺铂浓度梯度处理后胃癌细胞系中miR29b及其靶基因的表达；CCK8法检测miR29b 敲低状态和过表达状态下胃癌细胞受顺铂处理后的增殖情况，评估miR29b对胃癌细胞顺铂耐受性的影响。结果顺铂处 理后miR-29b表达量显著上调，其靶基因AKT2表达下调。过表达miR29b后胃癌细胞对顺铂抗性下降，干扰miR29b表 达后对顺铂的耐受性增强。Rescue实验结果显示，miR-29b通过AKT2促使胃癌细胞发挥对顺铂抗性的拮抗作用。miR29 家族另外两个成员miR一29ac受顺铂诱导上调表达，但二者对胃癌细胞顺铂抗性的产生无显著作用。结论miR29
3、b能够 通过靶向抑制PI3KAkt信号通路降低胃癌细胞对顺铂的耐受性。 关键词：胃癌；miR一29b；顺铂抗性 中图分类号：R34；R7352 文献标志码：A 文章编号：1000503X(2015)05051406 DOI：103881jissn1000503X201505005 miR-29b Reduces Cisplatin Resistance of Gastric Cancer Cell by Targeting PDKAkt Pathway CHEN Dian。dian ，FENG Linchun ，YE Rui ，HE Yuqi。，WANG Yadi Department of
4、Radiation Oncology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China Department of Oncology，Beidaihe Sanatorium of Beijing Military Command，Qinhuangdao，Hebei 066100，China Department of Gastroenterology 7 4 Department of Radiation Oncology，General Hospital of Beijing Military Command，Bering 100700，Ch
5、ina Corresponding author：FENG Lin-chun Tel：01066939296，Fax：010-84661080，Email：15811155735163corn ABSTRACT：Objective To investigate the regulatory effect of miR一29b on gastric cellsresistance to cisplatinMethods The expression of miR一29b in gastric cancer cell line treated with cisplatin concentratio
6、n gradient was detected using quantitative reversetranscriptase polymerase chain reaction(qRTPCR)and West erR blottingCCK8 was used to measure the cell viability after cisplatin treatment in condition of miR-29b knock down and overexpressionResults The expression of miR一29b was significantly upregna
7、hed by cisplatin treat- ment，while its target gene AKrlE was downregulatedThe up-regulation of miR-29b enhanced the sensitivity of gastric cancer cells to cisplatin，while the knockdown of miR一29b enhanced the cisplatin resistanceRescue ex periments demonstrated that the miR-29b might regulate cispla
8、tin resistance of gastric cancer cell by targeting 基金项目：吴阶平基金会临床科研专项资助基金(32067501084)Supposed by Wu Jieping Medical Foundation(32067501084) 514 0ctober 201 5 miR一29b通过靶向PI3KAkt信号通路降低胃癌细胞对顺铂的耐受性 PI3KAkt pathwayThe expressions of the other two members of miR-29 family，miR一29ac，were promoted by cisplat
9、in treatment，but they had no significant effect on gastric cancer cellS resistance to cisplatinConclusion miR-29b can enhance the sensitivity of S gastric cancer cell by directly targeting PI3KAkt pathway Key words：gastric cancer；miR-29b；cisplatin resistance Acta Acad Med Sin，2015，37(5)：514519 胃癌是一类
10、发病率及死亡率极高的恶性肿瘤，每 年约有90万人被诊断为胃癌，约有70万人死于胃 癌。现阶段其临床治疗方法通常是手术联合放化疗 为主_2j。化疗是胃癌治疗的重要手段，而顺铂是多种 联合化疗方案的核心药物。然而，化疗过程中胃癌细 胞往往会产生明显的耐药性，极大影响治疗效果。因 此，研究胃癌细胞的化疗药耐药机制并实现其有效逆 转对胃癌的治疗具有重要意义。microRNA在胃癌发生 发展过程中可发挥重要的调控作用 J。研究表明， microRNA可以参与多种肿瘤细胞的耐药调节 。 microRNA一29(miR一29)家族是一类抑癌基因，其对 胃癌细胞的增殖和转移发挥负调控作用 ，但其与胃 癌细胞化
11、疗药耐受之间的关系鲜有报道，本研究旨在 揭示miR29家族对胃癌细胞顺铂耐受性的调控及其 作用机制。 材料和方法 材料人胃癌细胞株SGC7901和HGC27购自中 国医学科学院细胞库，顺铂购自美国Sigma公司， MiR29abc类似物(miR。29abe mimic)和抑制剂 (antigomiR29b)购自上海吉玛生物科技有限公司， CCK8试剂盒购自日本同仁化学公司，AKT2抗体购自 美国CST公司，细胞培养基和血清均购自美国Gibco 公司，Trizol试剂、脂质体购自美国Invitrogen公司。 反转录使用美国Promega公司GoScript Reverse Tran scrip
12、tion System反转录酶，荧光实时定量PCR试剂购 自全式金生物科技有限公司。 胃癌细胞的培养与转染将SGC7901和HGC27 细胞接种于含有10胎牛血清的RPMI1640培养基中， 5CO，、37 oC常规传代培养。细胞采用脂质体法转 染，按说明书进行操作，将脂质体和mimic混合后无血 清条件下孵育细胞，8 h后换成完全培养基培养。 RNA提取、反转录和定量PCR 所有样品的 RNA均采用Trizol法提取。mRNA定量检测实验应用 olig(dT) 通用引物反转录；microRNA定量检测实验 使用microRNA特异茎环引物反转录。定量PCR引物 参考文献中序列7-8。荧光实时
13、定量PCR按照Trans Start Green qPCR SuperMix说明书进行。 顺铂处理胃癌细胞顺铂按照所需不同浓度用灭 菌的生理盐水稀释，对照组加相应的生理盐水。检测 miR一29家族3个成员miR一29abc表达时，顺铂浓度 分别为0、5、10、15、20 IIll，处理时间分别为0、 12、24、36 h。检测miR29b与胃癌细胞耐药性关系 时，顺铂处理浓度分别为0、5、10、15、20 gml， 处理12 h后采用CCK8法检测细胞存活率。 CCK8法检测细胞存活率转染细胞24 h后胰酶 消化重悬细胞并计数。调整浓度为1 X 10 ml，加到 96孔板中，每孔100 l。贴
14、壁后每孑L对应加入不同浓 度的顺铂或生理盐水。测定时加入CCK8试剂10 ， 37孵育2 h后，酶标仪450 nm检测吸光值。每组实 验设置5个复孔，独立重复实验3次，计算存活率。 Western blot检测按照标准Western blot程序进 行，每种蛋白样品上样量为30 g。 统计学处理采用SPSS 190统计软件，数据以 均数标准差表示，因数据皆满足方差齐性，故采用 双侧Student t检验，P005为差异有统计学意义。 结 果 顺铂可诱导胃癌细胞miR一29b上调表达 采用 qRTPCR检测了5、10、15、20 IIll顺铂分别处理 0、12、24、36 h后SGC-7901和
15、HGC一27细胞中miR一 29b的表达情况，结果显示，顺铂处理后miR一29b表 达显著上调，并且随着顺铂浓度的增加上调幅度逐渐 增大。同时，随着处理时间延长，3者上调幅度也表 现为上升趋势，miR-29b的表达上调与顺铂处理浓度 和处理时间呈正相关(图1)。 miR一29b能降低胃癌细胞对顺铂的耐受性过表 达miR29b后，胃癌细胞SGC7901和HGC一27对顺铂 的耐受性显著下降；当使用antigomiR-29b敲低miR一 29b后，SGC一7901和HGC27对顺铂的耐受性显著增 强(图2)。 miR-29b通过靶向抑制AKT2增强胃癌细胞对顺 铂的敏感程度采用终浓度为10 gm1
16、的顺铂处理胃 癌细胞12 h后，miR-29b靶基因AKT2的mRNA和蛋 中国医学科学院学报 白表达水平都下调(图3A)。当采用pcDNA31载体 过表达AKT2进行Rescue实验时，能够导致胃癌细胞 SGC一7901和HGC一27顺铂抗性增强；而当使用siRNA 干扰AKT2时，胃癌细胞SGC7901和HGC27顺铂抗 性减弱，与miR29b结果一致(图3B)。当采用miR- 29b mimic单独作用细胞时，胃癌细胞顺铂敏感性上 升；当单独过表达AKT2时，胃癌细胞顺铂敏感性下 降；当两者共同作用于细胞时，胃癌细胞的顺铂敏感 性低于miR一29b mimic单独作用而高于单独过表达 A
17、KT2(图3C)。 顺铂浓度(p+gm1) Concentration ofcisplatin(gm1) A c囊 留 荽 顺铂浓度(pgm1) Concentration of cisplafin(Ixgm1) 与阴性对照比较， P005， P0001 C P005 P0001 compared with scramble -R 蜒 聂 苠 400 200 O HGC一27 o o 顺铂处理时间 Time post cisplatin treatment 顺铂浓度(tgm1) Concentration of cisplatin(tgm1) B 顺铂浓度(ggm1) Concentratio
18、n ofcisplatin(pgm1) D AmiR一29b过表达对SGC一7901细胞顺铂耐受性的影响；BmiR一29b敲低对SGC一7901细胞顺铂耐受性的影响；CmiR29b过表达对 HGC一27细胞顺铂耐受性的影响；DmiR一29b敲低对HGC一27细胞顺铂耐受性的影响 Aeffect of miR一29b overexpression on SGC一7901 cisplatin resistance；Beffect of miR一29b knockdown on SGC-7901 cisplatin resistance； Ceffect of miR一29b overexpress
19、ion on HGC一27cisplatin resistance：Deffect of miR29b knockdown on HGC一27 cisplatin resistance 图2 miR一29b过表达或敲低对SGC一7901和HGC一27顺铂耐受性的影响 Fig 2 Effect of miR-29b overexpression or knockdown on SGC7901 and HGC27cisplatin resistance 516 0ctober2O1 5 占【ll 矗 一一00 2，B一 占专 矗 一一00 0A1苗一曲 烬翟 茛 姆g导茛 miR-29b通过靶向P
20、I3KAkt信号通路降低胃癌细胞对顺铂的耐受性 均表达下调；体内、外实验也都证明三者皆发挥抑癌 基因作用 。AKT2是PI3KAKT信号通路的关键分 子，对它的调控能够直接对PI3KAKT信号通路产生 调节作用。miR一29abc能够靶向抑制AKT2，从而发 挥抑癌作用，在胃癌发生过程中，由于miR29abc 表达下调，导致AKT2的表达激活，从而诱导了胃癌 发生 16。miR-29可否通过对PI3KAKT信号通路的 抑制作用从而调控胃癌细胞对化疗药的敏感性目前没 有研究。 本研究结果发现，化疗药物顺铂能够使miR一29b 表达上调，提示miR29b可增加胃癌细胞SGC7901和 HGC一27
21、对顺铂的敏感性。本研究还证实miR29b能 通过抑制AKT2调控PI3KAKT信号通路从而发挥胃 癌细胞顺铂耐受性的调控作用。Yu等 对卵巢癌的 研究显示，顺铂抗性的产生与miR-29家族下调有关， miR一29a、miR一29b和miR29c均对卵巢癌细胞的顺铂 耐受性发挥调控作用。但本研究中未发现miR29a和 miR一29c对胃癌细胞顺铂耐受性有显著的改变，推测 其原因可能是由于不同肿瘤细胞间差异造成的，但造 成这一现象的具体细胞差异和调控机制有待进一步研 究。同时也表明，在胃癌细胞中，尽管miR一29ac和 miR一29b一样能够抑制AKT2的表达，但两者可能更 侧重于在肿瘤增殖、侵袭
22、等其他方面发挥功能，而对 顺铂抗性产生的调节作用是由miR29b来负责介导完 成的。需要注意的是，目前本研究所得到的结论是基 于胃癌细胞水平的研究得到的，动物整体性实验验证 没有进行，因而后续试验中，裸鼠皮下移植瘤模型实 验等活体实验仍需要进一步开展，以确定miR-29b AKT2通路在体内对顺铂耐受性的调控作用。 1 2 3 4 参考文献 Herrero R，Parsonnet J，Greenberg ERPrevention of gas tric cancerJJAMA，2014，312(12)：1197-1198 Park JYvon Karsa LHerrero R Preventi
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