1、苍耳子提取物抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究【摘要】 目的研究苍耳子提取物对鸭乙型肝炎的抗病毒作用。方法选 1 日龄北京雏鸭，人工感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)后随机分为 5 组：苍耳子提取物 3 个剂量组（1，0.1 和 0.01 gkg-1d-1），对照组采用生理盐水和拉米夫定(3TC，2 mgkg-1d-1)，每组 6 只，灌胃10 d，观察不同剂量苍耳子提取物抗 DHBV 作用效果。结果苍耳子提取物(1 gkg-1d-1)剂 量组对延缓鸭肝病理改变有一定的作用，但对DHBV DNA 无作用。结论苍耳子提取物对控制鸭乙型肝炎病毒引起的病理改变有一定作用。 【关键词】 苍耳子提取物；鸭乙型肝
2、炎病毒Abstract：ObjectiveTo study the effects of extract from Fructus Xanthii duck hepatitis B virus.MethodsOne-day old ducks infected with DHBV were used as the hepatitis B virus infected animal model. The DHBV positive ducks were divided into 5 groups . Among the groups, three ones were treated with d
3、ifferent concentrations of extract from Fructus Xanthii（1，0.1 and 0.01 gkg-1d-1） for 10 days, control groups were treated with physiological saline and lamivudine(3TC, 2 mgkg-1d-1). ResultsThe high concentration of extract(1gkg-1d-1) could delay pathological changes of duck liver. But the three conc
4、entrations of extract had no effect on DHBV DNA in this experiment.ConclusionFructus Xanthii might delay pathological changes caused by Duck Hepatitis B Virus .Key words：Extraction from Fructus Xanthii; Duck hepatitis B virus全世界现有乙型肝炎病毒性（HBV）感染者约 4 亿，每年 50万120 万人死于慢性 HBV 感染及其导致的肝硬化和肝癌 1，研发有效地抗病毒药物是当
5、前科研工作者的重要任务。我国中草药资源丰富，毒副作用小，开展中草药抗 HBV 研究将成为今后我国科研工作者的研究方向之一。苍耳子始载于千金食治 ，系菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr 的成熟带总苞果实，味辛苦，性温，有毒。在抗病毒研究上，曾有用苍耳子液治疗扁平疣获得较好疗效；姜克元2采用苍耳子醇提取物研究其抗疱疹病毒作用，结果表明，苍耳子提取液 15 稀释可抑制病毒的生 长，1 10 稀释可抑制 100 TCID50。引起扁平疣的人乳头状病毒和疱疹病毒均属 DNA 病毒，乙肝病毒的核酸为DNA，苍耳子是否具有抗 HBV 的作用，本实验选用中草药苍耳子提取物，利用雏鸭作为
6、动物模型，研究苍耳子提取物抗鸭乙型肝炎病毒的作用。1 材料试剂与动物：苍耳子提取物(本院自制)，鸭血清标本、DHBV 阳性血清、斑点杂交试剂 (重庆医科大学)，拉米夫定葛兰素威康（苏州）制药有限公司；市售 1 日龄北京鸭。2 方法2.1 动物模型北京鸭经腹腔注射 0.1 ml 阳性血清，9 d 后取血，分离血清，-70保存待检。2.2 药物治疗筛选出感染成功的阳性鸭 30 只，随机分为 5 组，每组 6 只。苍耳子提取物分高、中、低 3 个剂量组，分 别为 1，0.1 和 0.01 gkg-1d-1灌胃，1 次/d ，给药 10 d；空白对照组选取为 感染 DHBV 阴性雏鸭。空白对照组及模型
7、对照组以生理盐水代替药物；拉米夫定（3TC）作为治疗对照组；以 2 mgkg-1d-1 灌胃，1 次/d，给药 10 d，分别用于药前(T0)，用药第 5 天(T5)，用药第 10 天(T10) 和停药后第 3 天(P3) 。自鸭颈静脉取血，分离血清，-70保存待检。2.3 检测方法采用赖氏法测定血清 ALT/AST 活性，斑点杂交法测积分光密度光度值(IOD)，并取停药 3 d 的鸭肝做病理切片，观察组织学改变。2.4 统计学处理用药组不同时间含量与用药前比较，采用成组 t 检验；用药组同一时间含量与病毒对照组比较，采用成组 t 检验。3 结果3.1 鸭肝 HE 染色切片用药前后的病理 变化
8、图 1 为正常鸭肝细胞；经 DHBV 感染后，鸭肝细胞（图 2）出现明显空泡变性，胞浆疏松，汇管区可见炎细胞浸润，有点状出血、坏死；3TC 鸭肝细胞（图 3）形态正常；使用不同浓度苍耳子提取物的雏鸭，其肝细胞（图 46）均有不同程度空泡变性、肿胀，部分可见汇管区及小叶间隔炎症细胞浸润，其中，苍耳子提取物高剂量组肝细胞水肿程度较轻，好于病毒对照组，随着苍耳子浓度降低，肝细胞病变程度逐渐加重，苍耳子提取物低剂量组肝细胞空泡变性程度较重，与病毒对照组无差异，并可见坏死、增生现象。3.2 T0，T5，T10 及 P3 鸭血清中 DHBV DNA 的变化将阳性雏鸭随机分为 5 组，T0T5T10P3 各
9、时期用药组与同期病毒对照组分别采血检测血清中的 DHBV DNA，斑点杂交实验结果显示：实验期间病毒对照组血清中 DHBV DNA 量较稳定，未见自然转阴者；阳性药物 3TC 组 T5、T10 与 T0 比较 DHBV DNA 量明显减少（P0.05），而 P3 DHBV DNA 有明 显反弹（P0.05）。苍耳子提取物各组（1，0.1 ，0.01gkg-1d-1）对血清中的 DHBV DNA 无抑制作用（见图 7,表 1，图 8）。表 1 T0，T5，T10 及 P3 血清中 DHBV DNA 改变情况（略）4 讨论HBV 感染抗病毒药 物的筛选需要进行体内 实验研究3。目前， 鸭乙型肝炎病
10、毒动物模型是卫生部规定的新药抗乙型肝炎病毒药效学评价的唯一动物模型4。鸭乙型肝炎病毒与人类乙型肝炎病毒同属嗜肝 DNA 病毒科，它 们在形态、基因组结构及复制方式上有相似之处，鸭子是 DHBV 的自然感染宿主，感染后在病因或肝脏病理方面类似人类乙型肝炎5。DHBV 感染雏鸭后 9d，外周血 DHBV 上升，感染 11 d 达到高峰，至 26 d 才开始下降至较 低水平。因此，适宜的 给药时间在 15 d 左右6，该时期的 DHBV 阳性雏鸭是用作药物筛选理想的模型。本实验在雏鸭体内病毒血症最稳定的时间内进行，虽然最适给药时间较短，但能够模拟与人体感染 HBV 相似过程，我 们认为仍可提示研究药
11、物的抗 HBV 效应。HBV DNA 是乙肝感染最直接、特异和灵敏的指标，我们利用斑点杂交技术检测鸭血清中 DHBV DNA 的表达，来判断药物治疗效应，结果提示，阳性对照药 3TC 组在用药期间能迅速降低血清中 DHBV DNA 的水平，但停药后病毒 载量反弹明显， 该现象与其在治疗 HBV感染时的情况一致，其原因可能是7，8由于病毒感染了宿主细胞后，HBV mRNA 和 cccDNA 整合在细胞核内，而 3TC 不能清除核内的mRNA 和 cccDNA。苍耳子提取物组血清中 DHBV DNA 水平在用药期间平稳，表明苍耳子提取物对 DHBVDNA 无抑制作用。经 DHBV 感染后，鸭肝细胞
12、病理切片表现出明显空泡变性，胞浆疏松，汇管区可见炎细胞浸润，有点状出血、坏死；经 3TC 治疗的鸭肝细胞形态正常，表明 3TC 组有明显减轻鸭肝炎性改变的作用。不同浓度苍耳子提取物治疗后的鸭肝细胞，只有苍耳子提取物高剂量组肝细胞水肿程度较轻，好于病毒对照组，随着苍耳子浓度降低，肝细胞病变程度逐渐加重。说明苍耳子提取物高剂量组对 DHBV 造成的病理改变有一定的减轻作用，但作用不如 3TC 组明显。本研究表明， 苍耳子提取物对延缓 DHBV 造成的病理改变有一定作用，对 DHBV DNA 无抑制作用，其机制仍需进一步探讨。【参考文献】1Lok AS,McMahon BJ. Chronic hep
13、atitis B.Hepatology,2007,45 (2):507.2姜克元, 黎维勇, 王 岚. 苍耳子提取液抗病毒作用的研究J.时 珍国药研究, 1997,8(3):217.3李常青, 刘妮 . 苦参碱脂质体抗乙型肝炎病毒的体外实验研究J . 热带医学杂志, 2003, 3（1）:19.4陈压西, 齐珍元, 黄爱龙. 碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒 DNA 方法的建立及应用J. 重庆医科大学学报, 2003,28（3）: 140.5胡权， 杨东亮.鸭乙型肝炎病毒感染模型的研究进展J.实用肝脏病杂志, 2007,10(3):201.6Lian Y, Tan J, De
14、ng Z. Experimental study of shuangcao granule no.1 on duck hepatitis B virus in ducklingsJ. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2000,20(7): 530.7苏海滨, 王慧芬, 季伟, 等. 拉米夫定与单磷酸阿糖腺苷联合应用抗-HBV 的体外 实验研究J . 中华实验和临床病毒学杂志, 2002, 16（1）:16.8Zoulim, Fabien. Combination of nucleoside analogues in the treatment of chronic hepatitis B virus infection: lesson from experimentalJ. British Society for Antimicrobial Chemotherapy, 2005,55(5): 608.
