1、摘要B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)是TNF家族中的一员，又称为B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)。在体内外实验中，可溶性BLyS(sBLyS)能够特异性作用于B细胞，诱导B细胞分化、增殖和存活。如果敲除BLyS，小鼠体内的T1期B细胞相对正常，T2期和成熟B细胞缺失。因此，BLyS在B细胞的成熟过程中发挥至关重要的作用。而在BLyS过量表达时，小鼠表现出自身免疫性疾病样症状，提示BLyS与自身免疫性疾病的发生密切相关。新近的研究发现，部分B细胞型肿瘤
2、细胞能够合成BLyS。分泌的BLyS，可能与自身细胞的BLyS受体结合，形成自分泌途径，参与B细胞肿瘤的生长与存活。因此，BLyS的拮抗剂可能成为治疗自身免疫疾病和某些肿瘤的新型药物。首先，我们根据BLyS与其受体的相互作用结构，设计出五个BLyS的突变体，以pET22b(+)sBLyS为模板扩增BlyS的突变体，然后，将突变体基因酶切下来，连接到原核表达载体pET32a(+)，进行表达、纯化，得到五个BLyS突变体蛋白(M1、M2、M3、M4、M5)。我们设计了两组实验检测BLyS突变体的功能。第一组实验：通过MTT比色法，用BLyS及其突变体刺激小鼠脾细胞来检测他们的功能；第二组实验：将B
3、CPC质粒(BCPC质粒为可表达BCMA蛋白的质粒)和NFK B-luc质粒共转染进入293T细胞，当BCMA在293T细胞表面表达后，用BLyS及其突变体刺激，根据检测的荧光值的不同来判断有意义的突变位点。根据两组实验的结果，我们得到BLyS突变体M2、M4、M5的突变位点有意义，其中突变体M5的突变位点最有意义，这将为我们根据确定的突变位点设计BLyS的拮抗肽提供了依据。关键词： BLyS突变体；脾细胞；MTT；转染293T细胞ABSTI认CTB lymphocyte stimulator(BLyS)，also known as B cellactivating factor belong
4、sto TNF family(BAFF)，or TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressedligand 1(TALLl 1 is a member of Tumor Necrosis Factor(TNF)familyIts roles in Bcell development and autoimmune diseases have been studied intensivelyn vitroexperiments demonstrated that BLyS could bind B cells，stimulate their
5、 proliferationand promote their survivalIn BLyS小mice，there are no mature B cells in peripherallymphoid systemsIn contrast，overexpression of BLyS in transgenic mice results inincrease of peripheral B cells significantly and leads to autoimmune diseaseslikesymptomsNewly studies suggested that BLyS and
6、 its receptors might be involved inthe growth and survival of multiple myeioma(MM)and lymphma cellsMoreinterestingly,some patientsMM cells as well as MM and B cell lymphoma cell linesexpress BLyS and may form an autocrine loop to stimulate their growth and promotetheir survivalIn this studies，we fir
7、st designed five BLyS mutants，considered with structuralcomplementary and electrostatic matching while BEyS and its receptor contacted eachother,amplified them with pET22b(+)sBLyS，then cut mutants gene with restrictionenzymes，ligated them to pET32a(+)After expression，purification，we got five BLysmut
8、ant proteinsFor detecting function of BLyS mutants，we design two experimentsFirst,with MTT chromatometry，we detected their function，by BLyS and BLySmutants stimulated splenocytes of mouseSecond，after transfected 293T cells withthe NFK 13-1uc plasmid and BCPC plasmid，BLyS and BLyS mutants stimulated
9、thetansfected cells when BCMA expressed on the cell surfaceThen we choiced goodmutant sites by luciferase assayOn the basis of two experiments，we show thatmutant sites of M2，M4，M5 were significancely，especially M5So，we can designBLyS antangonist peptide based on mutant sitesKEY WORDS：BLyS mutants，sp
10、lenocytes，MTT,transfected 293T cells天津大学药物科学与技术学院二零零八年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了辩丞洼太堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权玉洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采_jl影印、缩印或扫描等复
11、制手段保存、汇编以供奇阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名： 互i嘶期：钞产j月目 l别獬纠 口即签字日期：工。叩年厂月西El第一章文献综述第一章文献综述B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)，又称为THANK(TNFhomoiogue that activates apoptosis，nuclear factor rB and C-jun NH2-terminal kinase)，1ALL-1(TNF and apoptosis ligandrelated leukocy
12、te expressed iigand-1)，BAFF(Bcell activating factors belonging to the TNF family)1-4 是1 999年发现的肿瘤坏死因子家族的第13位成员。BLyS作为B淋巴细胞的共刺激因子，参与体液免疫调控，在维持B淋巴细胞的动态平衡中发挥重要作用，其正常表达对维持依赖和不依赖T细胞抗原刺激的B细胞活化和增殖至关重要隋3。但BLyS的过度表达可会促使B淋巴细胞不断增殖并使分泌的自身抗体增多，从而导致一系列自身免疫性疾病。11 BLyS的结构及组织分布BLyS是典型的II型跨膜蛋白，N端在胞内，缺少信号肽序列，C端在胞外。人的B
13、LyS全长为285个氨基酸，其中N端146位氨基酸为胞内区，47“-73位氨基酸为疏水的跨膜区，其余为胞外区，133285位氨基酸为其发挥功能的主要区域n一。BLyS在体内以膜结合型和水溶型两种形式存在，二者生物学活性基本一致。膜结合型BLyS在蛋白酶的作用下水解第132或133位氨基酸，产生由152个氨基酸组成的可溶性活性多肽，释放入血即为可溶型BLyS，其常以三聚体的形式存在。在中性和碱性条件下，20个可溶的重组BLyS三聚体，可相互结合为BLyS的60聚体，并在酸性条件下不可逆的分离。这种结合依赖于BLyS特有的“Flap”环，其他TNF家族成员蛋白没有此结构，且BLyS的60聚体的生理
14、作用还不清楚哺1。Moore等采用RNA杂交与流式细胞技术分析了BLyS的表达分布，发现BLySmRNA主要表达于人外周血单核细胞、脾、淋巴结和骨髓，在胎盘、心脏、肺、胎儿肝脏、胸腺和胰腺等也有弱表达。BLyS大量存在于外周血及淋巴组织细胞的培养上清中，主要由嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌。BLyS的表达水平受到许多其他第一章文献综述因素的严密调控，如IFNY和IL-10可上调膜结合型BLyS的表达及可溶型BLyS的释放，其中以前者的上调作用更为强烈，IL-4可下调BLyS的表达，某些有丝分裂原如PMA也可显著下调BLyS的表达。12 BLyS受体的结构特征与组织分布目前已知BLyS有3个受体：分
15、别是B细胞成熟蛋白(13 cell maturation ProteinBCMA)、 跨膜激活与CAML作用因子(transmembrane activator and CAMLinteracton，TACI)及BR3(BLyS receptor 3，BAFFR)7-10，其中BR3是存在于B细胞上的特异性受体，而?ACI和BCMA还是TNF超家族的另一成员APRIL(Aproliferationinducing ligand)的受体。三者都主要表达在B细胞表面，受体胞外区有可与BLyS形成受体一配体结构的半胱氨酸富集区(CROs)。121 TACITACI含有293个氨基酸，存在于B细胞和活
16、化T细胞表面，其胞外有2个半胱氨酸富集区(CRDs)，由于没有信号肽，被划分为型膜蛋白。有研究表明：TACIN端的2个CRD可被选择性的剪切掉1个，但是对于配体诱导细胞信号的能力没有丧失，而J了TACI的第2个CRD对相应的配体有完全的亲和性阻。122 BC凇BCMA为185氨基酸组成的非糖基化单链蛋白，由于没有信号肽，也被划分为I型膜蛋白，主要表达在成熟B细胞表面，其胞外区序列很短，只有一个CRD，其与BLyS的结合能力最弱n驯。123 BR3BR3是BLyS的特异性受体，全长184个氨基酸，也为I型膜蛋白，由70个2第一章文献综述氨基酸残基组成的胞外区序列中只有4个半胱氨酸残基，构成的CR
17、D结构，是目前发现的最小的CRD序列，但BR3和BLyS的亲和力明显高于其他两个受体n副。13 BLyS的信号传导途径BLyS信号传导途径的阐明，有助于我们了解BLyS发挥功能的机理，Xian31等通过酵母双杂交发现TACI通过TRAF2、TRAF5和TRAF6传递信号，进而引起NF-K B、AP-1以及NFAT的活化。Hatzogloun钉等在对BCMA的研究中，将BCMA与TRAF家族的6个成员共转染COS7细胞，免疫共沉淀分析发现BCMA通过TRAFl、TRAF2和TRAF3激活NF-K B、JNK以及P38等。与大多数TNF家族成员相似，BLyS通过与其受体作用，激活核转录因子NF-K
18、 B，NF-K B的激活上调了抗凋亡蛋白bcl-2的表达，从而抑制了细胞的凋亡，促进了细胞的增殖。14 BLyS的主要生理功能BLyS的生物学活性主要是通过与其相应的受体作用而实现的。BLyS的三个受体均含有与配体相结合的CRD，但不含有死亡区域的功能区，因而与BLyS结合后不能诱导细胞凋亡，而是通过激活NF-K B等信号，进而促进细胞的增殖、分化和成熟。141 BLyS对B淋巴细胞的作用1411 BLyS对B淋巴细胞的共刺激作用BLyS有很强的B细胞趋化性，作为一种B淋巴细胞的共刺激因子，BLyS对活化的B细胞有强烈的促进增殖和刺激分泌抗体作用，MoorehI等人通过体外实验证明，在Anti
19、-IgM预刺激下BLyS能诱导B细胞分泌大量的IgM和IgA。对于休眠B细胞，第一章文献综述BLyS虽然不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl的大量表达，延长了休眠B细胞的寿命。1412 BEyS调节B淋巴细胞的增殖、分化、成熟小鼠未成熟B细胞产生于骨髓中，发育的早期表达特异性的抗原受体(BCR)，如与外来抗原结合，产生负应答，使绝大部分非成熟B细胞发生克隆性删除，少数存活的B细胞经血液迁移至脾脏成为T1-B细胞(IgMhlIgD)，接着T1-B细胞表面表达IgD，而成为T2一B细胞(IgMIgDM)，在脾脏微环境中的各种细胞因子的刺激下，T2
20、-B细胞依赖BCR引发的信号选择，一部分迁移至脾脏的边缘区(MarginalZone，MZ)，发育成MZB淋巴细胞(IgMMIgDCD21M CDl)，一部分发育成成熟的滤泡B淋巴细胞(IgM“1IgDmCD21妇)，被相应抗原或多糖刺激后成为活化的B细胞，再经一系列连锁反应形成分泌Ig的浆细胞和记忆性B细胞n 51。近来研究者通过不同的策略建立了一系列BLyS缺陷，转基因动物模型，并且将受TACI、BCMA与人IgGl的Fc段构建成融合蛋白，注射进入小鼠体内，深层次揭示了BLyS在机体免疫尤其在B淋巴细胞的增殖、分化、成熟等方面的作用。在体内，BLyS对囊外B淋巴细胞的活化及抗原特异性IgM
21、的分泌、免疫球蛋白的同型转化和脾脏生发中心的形成有重要作用。Richardn等证实TBLyS在体内能够增强非依赖T细胞和依赖T细胞的体液免疫，在BLyS的作用下，血清中IgM含量分别提高25倍。Schiemann61和Gross乜们等分别建立了两种BAFF小鼠模型发现：脾脏边缘区和滤泡中B220+B细胞几乎完全消失，脾脏重量明显减轻；胸腺pre-B细胞和外周血中T细胞数目没有变化；针对TI和TD抗原的体液免疫能力显著下降，因此BLyS在T1-B细胞向T2一B细胞的转化中起着至关重要的作用，另外也有人认为T2-B细胞必须依赖BLyS提供生存信号，否则由于凋亡而阻断整个B细胞的成熟。xu啪3等人建
22、立了BCMA一鼠的模型，发现小鼠的整个免疫系统仍然正常运作：脾脏的结构、生发中心的形成、B淋巴细胞的发育、针对外来抗原(包括Ti型和Td型)的体液免疫都很正常。这些现象的产生表明BCMA似乎是BLyS的“多余受体”，TACI和BAFFR足以介导BLyS的作用。4第一章文献综述Von Bolow等建立了TACI一鼠，其表型完全与BCMA一鼠不一样：富含B淋巴细胞的滤泡和边缘区肿大，脾脏和淋巴结B细胞、动脉周围淋巴鞘的树突状细胞数目增多，骨髓中T2-B细胞及其后期的非成熟B细胞要多于TI-B细胞。体外实验表明从TACI叫鼠分离出来的B细胞在LPS和抗CD40抗体的刺激下，更易产生IgM、IgGl、
23、IgG2a、IgE，因此在体内，TACI的存在抑制BLyS作用的发挥。BR3十鼠外周血淋巴器官中B细胞数目大量减少，出现了与BLyS十鼠相似的免疫缺陷症状，近来有人晗钔指出BR3与TI-B细胞向T2-B细胞发育直接相关。由于BCMA-卜鼠和TACI叫鼠并没有表现出免疫缺陷症状，说明BLyS和BR3组成的配体受体系统在B细胞发育过程中起主要作用。142 BLvS对T淋巴细胞的作用一些研究小组认为BLyS具有强烈的B细胞趋化性，而对T细胞不起作用，但Gross乜21指出，在BLyS的转基因小鼠中，脾脏内T细胞总数虽然没有明显上升，但CD4+和CD8+T细胞呈现活化状态，而且这些细胞表面的CD4+水
24、平上升，LECAM水平下降。此外，流式细胞仪和BIAcore表明BLyS能与少量的活化T细胞结合。由于T细胞表面表达受体TACI，有人口51用TACI-Fc研究TBLyS对T细胞的作用，在抗CD3单抗辅助作用下，TACIFc能够明显抑制鼠脾细胞中T细胞增殖活性，而且IL-2分泌呈剂量依赖性的降低。分析其中CD4+T细胞上活化标志的表达，发现TACI-Fc处理后，T细胞上活化状态标志的表达相对降低，而CD62L呈高表达，表明TACI-Fc可在体外抑铝IJCD4+T细胞的活化。用KLH蛋白预先免疫小鼠，再用鼠TACI-Fc处理后，与对照组比较，9天后发现引流淋巴结体积明显缩小，分泌的IL-2和IF
25、NY量显著降低，表明TACI-Fc可抑制抗原特异性的T细胞活化。Gross等1报道指出BLyS转基因小鼠脾脏内的CD4+和CD8+亚型的T细胞都呈现活化状态。这些都信息都表明BLyS密切的参与了T细胞所介导的免疫应答。第一章文献综述15 BLyS相关的免疫疾病151免疫缺陷病免疫缺陷病是由于一种或多种免疫系统缺陷引起的多种症状疾病，70的病因是免疫细胞的异常。普通可变性免疫缺陷症(common variableimmunodeficiency，CVID)就是一种由于B细胞异常引起的免疫缺陷综合征。患者的B细胞不能分化为分泌抗体的浆细胞，因此不能抵御一些病毒、细菌等的感染。IgA缺陷症也是一种对
26、感染敏感性增高的免疫疾病，其病因可能是由于患者体内的免疫B细胞最终不能分化成产生IgA抗体的浆细胞。BIyS对以上述2种疾病有一定治疗效果。HGSI(Human Genome Sciences，Inc)公司研究发现：BLyS能刺激CVID患者的离体B细胞增殖、分泌抗体；亦能够使IgA缺陷症患者的B细胞产生IgA，且产量高于正常水平。BLyS缺乏的小鼠免疫力明显降低，主要表现如下：特异性的外周淋巴细胞的数量明显减少；脾脏重量下降，而且其成熟滤泡和边缘带的B细胞几乎完全缺失，剩余的B细胞多为类似T1过度型，几乎没有T2表型。向这种小鼠腹腔注射T细胞依赖型抗原NPKLH，早期检测不到特异性的抗体反应
27、，晚期反应也很微弱。注射非T细胞依赖型抗原TNP-Fi col 1，也得到相同的结果乜引。152自身免疫疾病大量实验表明：BLyS过表达与自身免疫疾病(autoimmune disease，AID)的发生和发展有关，如：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)及干燥综合征(Sjogrens syndrome，SS)等。Zhang瞳铂等研究发现，在SLE患者血清中，BLyS水平较正常人明显升高；与SLE患者一样，RA患者血清中的BLyS水平也升高，并且与类风湿因子(rheumatoid fa
28、ctor,RF)成正相关，同时RA患者关节滑液中的BLyS水平也上升，可能与关节局部的病理损伤有关乜引；SS患者发炎的唾液腺中BLyS的表达亦明显上调。在这些自身免疫疾病中，SS的致病机制与B细胞功能障碍之间的联系最大，SS患者循环中BLyS水平的增加使B细胞大量增殖，并侵润到唾液腺、泪腺、上颌腺等外分泌腺，导6第一章文献综述致这些器官的功能障碍心引。此外，Wil 1 Jamb叫等发现在HIV感染的患者中，单核细胞表面的BLyS表达量与血清中BLyS的量都增加。BLyS转基因小鼠除表现出多克隆高球蛋白血症外，还伴有严重SLE样病症n3，随着小鼠年龄的增长会出现SS样病理症状腰引。还有些实验表明
29、BLyS转基因小鼠注射能与BLyS结合的物质(比女nBLyS的抗体或BLyS受体的可溶性蛋白)能够缓解小鼠的病情。153淋巴瘤最近研究发现，BLyS可能还与某些肿瘤的发生有关。Briones等发现在滤泡型非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinS lymphoma,NHL)患者的血清OOBLyS水平较正常人高3倍；但慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,BCLL)患者的B细胞表面BLyS受体的表达则较正常明显下降，提示BLyS可能与这些肿瘤的发生有关。Novak21等研究还发现在部分B_CLL受检者的B细胞突变表达BLyS的mRNA及低水平的BLyS，这种情
30、况在正常的B细胞中是不可能发生的。此外，BIyS还与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的发生有关。16临床应用前景161 BLyS治疗性蛋白BLyS能够在体内外刺激B淋巴细胞的增殖，具有增强免疫反应的功能，故可以在生理条件和免疫功能低下的情况下，作为一种免疫增强分子治疗先天性或后天获得性免疫缺陷症或免疫功能低下。CVID患者抗体分泌过少，抗感染能力低下，BLyS蛋白能够提高患者的抗体水平，缓解其病情；BIyS蛋白可刺激老年患者的免疫系统，提高他们的抗感染能力；有些癌症也会减少患者的抗体分泌使其易被病毒感染，而且癌症的治疗过程会损伤免疫系统，BLyS蛋白能提高癌症患者的抗感染
31、能力，加快恢复正常抗体反应，器官移植的接受者多会使用些免疫抑制药，BLyS蛋白能帮助患者维持正常的免疫反应来抵制感染，很多细菌性7第一章文献综述感染会对抗生素类药物产生抗性，这可能是由于机体内免疫应答不充足，BLyS蛋白可提高此类患者的免疫防御功能；此外，BLyS蛋白可与某些疫苗联合使用，一方面通过刺激B细胞的增多来提高有效疫苗的量；另一方面能加强疫苗的免疫反应。可见，BLyS作为一种治疗性蛋白的医学应用前景是很广泛的。目前，HGSI公司已经研究出一种针对免疫缺陷症的BLyS治疗性蛋白。2000年6月该公司宣称应用BLyS治疗性蛋白治疗CVID已进入I临床试验阶段，2001年2月通过了美国FD
32、A认证，I期临床试验阶段已结束。结果表明：BLyS具很好的安全性和耐受性。2001年9月FDA批准BLyS蛋白治疗IgA缺陷症的临床试验申请。162 BLyS蛋白拮抗物BLyS过表达必将引起机体内B和T淋巴细胞的异常活化，自身抗体水平升高，致使自身免疫耐受性减弱或破坏，一些自身免疫疾病也就随之发生。因此，阻断BLyS的生物学活性可使这两种淋巴细胞活化受抑，从而有可能为这些自身免疫性疾病的治疗提供新方法或新型药物。目前，关于拮抗BLyS生物学作用的研究主要有两方面：一是BLyS的可溶性受体(sTACI-Fc或sBCMA-Fc)，又称“诱导受体”(decoy recepter)，它竞争性地抑$0B
33、IyS与B和T细胞表面的受体结合，阻断BlyS的信号传导通路。Wang瞳73等发现sTACI-Fc能够在体外阻断T细胞的活化，在体内抑制特异化抗原T细胞的激活，还能够减轻RA模型小鼠的炎症、抑制骨和软骨的损坏及关节炎的发展。Gross阻等又发现向BlyS转基因小鼠体内注射sTACI-Fc或sBCMA-Fc，可减少小鼠蛋白尿的产生并延长其存活时间。此外，sTACI-Fc可减少SLE样小鼠体内活化B细胞的数量，抑制其肾炎的发展。二是用BLyS单克隆抗体拮抗BLyS的生物活性。HGSI公司与CAT(Cambridge Antibody Technology Commit)公司签定协议准备共同开发an
34、t iBLyS的抗体。2001年LymphoStatB作为BLyS的单克隆抗体进入I期临床试验阶段，结果表明：LymphoStat-B(毙够降低SLE患者体内的B细胞水平，是一种安全的并在体内具生物活性的药物，目前己通过FDA的认证。其II期临床试验结果表明：其具有良好的安全性、耐受性和生物学活性，且能减轻类风湿性关节炎的症状。3第一章文献综述163放射性BLyS蛋白非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤等都是与B细胞异常有关的肿瘤疾病，这些患者的B细胞都处于恶性增殖的不受调控状态。但是这类肿瘤对放射性物质很敏感，因此可根据B细胞表面分布的BLyS特异性受体，以BLyS为载体结合放射
35、性原对B系淋巴瘤进行靶向治疗。目前，用于靶向治疗的放射性BlyS蛋ElLymphoRad已进入I期临床试验阶段。LymphoRad可用于治疗广泛的B系淋巴瘤，如多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨大B细胞淋巴瘤、滤泡型B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤等；携带能够杀死细胞的低剂量放射原，仅与B细胞和肿瘤B细胞结合，作用的特异性很强，具有很小的杀伤范围，不会损害其他正常组织，此外它不会作用于前体B细胞，损失的B细胞就会得到补充，可降低不良反应。17结论和展望BLyS是机体免疫中的一种重要调控因子，参与B和T两种免疫细胞的活动调节。它的异常表达会引起机体免疫失衡，进而引发一些与其相关的的免疫疾病。
36、因此，对BLyS的深入研究将有助于阐明许多免疫疾病的致病机制，也有助于发现新检测方法、新治疗法以及新药的研发。根据BLyS的生理功能，人们己开始设计和尝试以BLyS及其受体为作用靶点的治疗新措施，而且已有许多相关制品已进入临床试验阶段。随着科学技术的进一步发展，BLyS相关制品的研制与开发将会越来越多，人类的免疫类疾病也将会得到进一步控制。9第二章BLyS突变体的设计与构建21引言第二章Blys突变体的设计与构建BLyS的主要作用是刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体，其正常表达对维持依赖和不依赖T细胞抗原刺激的B细胞活化和增殖至关重要，因此可作为体液免疫增强剂。但BLyS在体内的过量表达与自身
37、免疫疾病(如：系统性红斑狼疮，风湿性关节炎等)的发生和发展密切相关，因此研究BLyS的拮抗剂至关重要。为了研究BLyS与其受体的相互作用，进而设计出BLyS的拮抗剂，我们根据蛋白数据库的Blys与其受体相互作用的结构，考虑NBIys与其受体相互作用表面结构特征和相互作用残基的物理化学性质，设计BBLyS突变体。22材料及来源221试剂DNA分子量标准(bP)：DL20002000 1000 750 500 250 100，购自Takara公司。工具酶EcoR I，HindIU购自Takara。T4 DNA(3uu L)连接酶，TaqDNA(5u弘L)聚合酶，限制性内切酶Eco I，Xba I，
38、EcoRI购自Biolab公司。质粒中量提取试剂盒，DNA回收试剂盒购自Promega公司。卡那霉素，哈尔滨制药总厂，氨卞青霉素(Amp)：025m91支(华=lLSfJ药厂)。222主要试剂及溶液的配制实验室常用试剂、缓冲液的配置方法1)TE缓冲液：lOmMTrisHCI(pH80)，ImM EDTA(pH80)。2)05 M EDTA(IL)：在800ml-蒸水中加入1869 Na2EDTA 2H：0搅拌，加10第二章BLyS突变体的设计与构建入NaOH(约209)调pH至80，定容后高压灭菌。3)酚一氯仿一异丙醇混合液：酚、氯仿、异丙醇按比例24：23：1的比例混合转入棕色瓶中，常温保存
39、。4)上样缓冲液：025S溴酚兰、025-甲苯青FF、50(vv)甘油水溶。5)IOSDS：log SDS力n入80ral去离子水中，加热搅拌溶解，定容至lOOml。6)氯仿一异丙醇混合液：氯仿、异丙醇按比例24：l比例混合，常温保存。7)05M tris-HCL(PH：80)： 60579Tris，用适量三蒸水溶解，加浓盐酸用酸计调节PH至80，加水定容至1L，灭菌。8)LB培养基：称取5 g蛋白胨、25 g酵母提取物、 5 g NaCl磁力搅拌，溶于500 mLH。0，无需调节pH值，高压灭菌20 min(小量培养：配制LB培养基分装至培养试管中，再高压灭菌)，置4冰箱保存备用。含琼脂糖L
40、B培养基：如上LB培养基，高压前加入75 g琼脂糖，高压结束后，取出时轻轻旋转使琼脂糖均匀分散，但勿产生气泡。培养基温度降至50(手感微烫)加入氨苄青霉素(终浓度50100 la gmE)。超净台中铺培养平板。2YT培养基：称去169蛋白胨、lOg酵母提取物、59NaCl、磁力搅拌，溶于800ml去离子水中，用5mol1的NaOH调pH值为70，定容1L，高压高温灭菌后4冰箱保存备用。9)氯化钙(Promega)：1M CaCl2：549 CaCl：加H20定容至200ml溶解，022tm滤器过滤，分装存-20。核酸电泳相关试剂、缓冲液的配置方法1)50TAE Buffer：称2429 Tri
41、s碱，3729 Na2EDA2H。0，加入800ml去离子水，充分溶解，再加入57Imi醋酸，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。2)10TBE：称1089 Tris碱，559硼酸40mlO5M EDTA(pH 80)定容至1000ml；5TBE-549 Tris碱、2759硼酸溶于800ml二蒸水中，加入20ml 105MEDTA(pn80)定容至1000ml，储存于常温。3)10MOPS Buffer：称量4189 MOPS，置于1L烧杯中。加约700ml DEPC处理水，搅拌溶解。使用2N NaOH调节pH值至70。再向溶液中加入1M NaOAc(DEPC第二章BLyS突变
42、体的设计与构建处理)20ral，05WE3TA(pH80)(DEPC处理)20ral，用DEPC处理水将溶液定容至1L。用045 ram滤膜过滤除去杂质，室温避光保存。4)EB(10mgm1)：1Oml水中加入019 EB，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶中，用铝箔包好试剂瓶，常温下保存。5)6Loading Buffer：称取EDTA 449、Bromophenol Blue 250rag、XyieneCyanol FF 250rag，置于500ral烧杯中，向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。加入180ral甘油后，使用2N NaOH调节pH值至70。用去离子水定容至50
43、0ml后，室温保存。223主要仪器设备1)PCR扩增仪(MJ Research)2)超净工作台(Thermo forma AB3)3)台式低温高速离心机(eppendorf 5415R)；落地式高速冷冻离心机(Beckman Avant i J一3QI)4)恒温空气摇床(Thermo forma)5)紫外分光光度计(Beckman DU-640)6)电泳系统(Thermo EC)7)恒温水浴箱(Thermo forma)8)恒温培养箱(Binder)9)凝胶成像系统(Alpha-DE500)10)-80C低温冰箱(Thermo Forma，91 7)11)多功能紫外检测器(上海康华)自动部分收
44、集器(上海青浦沪西)12)纯水装置(Elix 5，Mi l l ipore，Wi ll i-O Plus，France)13)制冰机(Scotsman AF 10，USA)14)全自动高压灭菌锅(Tomy SS-245，Japan)15)图像捕获系统(Spot RT color Di sgnostic公司)12第二章BLyS突变体的设计与构建224载体、细菌菌株1)pET22b(+)sBLyS，pET32为本实验室保存。2)大肠杆菌JMl09，BL21为本室保存。23方法231 BLyS突变体的设计利用BlyS晶体结构，在赋氢原子坐标后，设定CVFF力场，通过最陡下降(收敛判据005Kcalm
45、ol，收敛步长8000步)、共轭梯度(收敛判据002Kcalmol，收敛步长10000步)对BlyS三维构象进行分子力学最小化处理。基于B1yS与其受体BCMA、TACI、BR3相互作用的复合物晶体结构，选择相应的力场参数，通过分子力学、动力学模拟对复合物结构进行力学优化。在获得相应稳定构象的基础上，利用距离几何学、分子间氢键、Vander Waals相互作用模式对复合物作用结构进行分析，并结合BlyS稳定构象进行综合评判，确定BIyS功能域，设计相应的突变体。232 BLyS突变体基因的克隆2323引物设计根据Genbank的BlyS基因序列，利用美国Cold Spring Laborato
46、ry设计的PCGENE分析软件，对序列作酶切位点分析后，以本室构建的pET22b(+)sBLyS为模板，根据重叠延伸PCR定点诱变技术的原理，每个突变体合成4条引物，两条为外侧正、反向引物，两条为诱变引物。引物设计后，由Invitrogen生物公司合成部合成。第二章BLyS突变体的设计与构建2324重叠延伸PCR定点诱变重叠延伸PCR定点诱变需要三个PCR反应来完成。以突变体M1为例，首先以已构建的基础质粒pET22b(+)sBLyS模板，正向侧引物F1和诱变引物Panl，为上下游引物，进行PCR扩增(PCRl)，扩增突变位点及其上游序列的DNA片段FRml。同时也以pET22b(+)sBLy
47、S为模板，以诱变引物Fml和反向外侧引物R1为上下游引物，进行PCR扩增(PCR2)，扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段FmRl。这两个PCR可以同时进行。各取PCRl和PCR2的产物FRml和FmRl 1 u l为模板，以正、反向外侧引物F1和R1为上下游引物，进行第三个PCR。通过第三个PCR，用外侧引物将片段FRml和FmRl拼接而成全长含突变位点的产物FRl。以上PCR反应条件相同。PCR反应体系均为25 u l，各组分如下：10 Xbuffer 25 u 1MgCl2(50 mM)05 u ldNTP Mix(10 mmolL)05 p l上游引物(10 Il molL)02 p
48、 l下游引物(10 u molL)02 u lTaq DNA聚合和酶(5uu 1)02 u 1模板DNA 1 ti l加水至 25 u l循环参数为：95预变性5 min，94变性30 S，58退火40 S， 72延伸45 S，30次循环，72延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测1)制备凝胶：称16 g琼脂糖，加lOml DEPC水加热溶解琼脂糖，再加入5甲醛凝胶电泳缓冲液及甲醛，终浓度分别lX和22 molL(将123molL甲醛储备液，琼脂糖水溶液和5X甲醛凝胶电泳缓冲液按l：35：11比例混合即可)。然后按常规方法制14的胶。2)样品制备DNA5变性电泳液14225 U l100 p l
49、第二章BLyS突变体的设计与构建甲醛 175 u 1甲酰胺 5 II 16515分钟，冰浴冷却，稍稍离心。3)电泳上述样品加1 u 1灭菌的经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液，混匀后上样。电泳，恒压3-4cm，电泳15分钟，然后紫外检测并拍照。2325回收目的DNA用TIANGEN DNA回收试剂盒回收目的基因。首先用干净的手术刀小心切下含目的条带的胶块放入以干净的EP管。称取重量，以质量体积比为1：3加入溶胶液，在50“C的水浴里小心晃动直至胶块完全溶化。然后吸取EP管内的液体加入吸附柱内离。5,12000rpm，30s，弃掉废液，加700肚漂洗液离一5,12000rpm，30s弃调废液，NS00“L漂洗液离一tM2000rpm，30s，弃调废液后空管离一t,12000rpm，2m
