1、山东大学硕士学位论文A J8l，啦对SH-SY5Y细胞T514位点磷酸化CRMP2表达的影响研究生：朱天瑞导 师：李晓红教授摘要研究背景阿尔茨海默病(Alzheimers Disease，AD)是最常见的神经系统变性病之一，主要病理特征之一是脑内3-淀粉样蛋白(13一amyloid peptide， A13)水平增高，在细胞外沉积形成老年斑。B淀粉样蛋白1-42(A131越)是形成早期老年斑的主要成分，有明显的自聚集倾向和破坏作用。CRMPs(collapsin response mediator protein)是一类二氢嘧啶类磷蛋白，有5种亚型：CRMPl5。CRMPs在神经系统中表达丰富
2、，在神经发育过程中起着重要作用。在成年以后神经组织内主要表达CRMP2。研究表明CRMP2通过结合微管蛋白促进微管聚集，调节轴突生长。CRMP2的功能受多种蛋白激酶的磷酸化作用调节，其中T514位点磷酸化使CRMP2与微管蛋白二聚体结合的正常功能受损。 目的采用全反式维甲酸诱导人神经成瘤细胞SHSY5Y，细胞外给予聚集态ABl42构建细胞损伤模型。观察聚集态A131啦对细胞存活率、轴突生长状态、细胞微管结构及细胞内T514位点磷酸化C砌P2表达的影响。方法体外培养人神经成瘤细胞SHSY5Y，细胞外给予全反式维甲酸诱导分化7天。制备聚集态Aplm，对诱导后SHSY5Y进行处理24小时。应用MTT
3、法检测不同浓度Apl啦对细胞存活率的影响；采用细胞化学法观察Ap。42对细胞轴突生长状态的影响；运用免疫荧光细胞化学法观察ApI越对细胞骨架微管结构和细胞内I“514位点磷酸化CRMP2表达及分布的影响；应用Westen blot分析T514位点磷酸化CRMP2在细胞内表达水平的变化。结果1体外培养人神经成瘤细胞SHSY5Y，采用lOpmolL全反式维甲酸诱导分化7天后，在显微镜下观察到明显的形态学变化。细胞不再聚集成团，分裂明显减慢，开始向神经元分化：胞体由多角形变为椭圆形，形成一根或几根较长轴突，细胞呈现出明显的极性。对照组细胞生长迅速，仍维持上皮样细胞形态，无较长轴突形成。2MTT试验结
4、果显示，聚集态A131趣具有一定的神经毒性作用，应用不同浓度山东大学硕士学位论文(O1nmolL、lnmolL、10nmolL、01lmaolL、1laxnolL)处理能抑制细胞生长，存在一定剂量依赖性相关关系。在所选浓度中以01lamolL及19rnolL聚集态Apl42处理SHSY5Y细胞时，可见细胞存活率较对照组显著降低(p005)4Immunofluorescence result showed that in control group there was homogeneous distributionof green fluorescence(on behalf of FITC-
5、a-tubulin immunoreactive product)both in thecytoplasm and axonnle硎fluorescence(TRITC labeled T5 1 4 phosphorylation of CRMP2immunoreactive products mainly distributed in the cell bodyAfter the treatment、析m aggregatedAB 142，cell axon became retractedMicrotubule network structure was blurred谢tll mored
6、istribution of red fluorescence in the cell axonThe statistic analysis showed that there was nosignificant difference of the average area of green fluorescence between different groupsCompareed witll control group and 01 pmolL treatment groupthe average green fluorescenceintensity of cells Was signi
7、ficantly lower Q20肛m时纳入计算)。 ，实验室同一条件下重复3次。5免疫荧光法观察SHSY5Y细胞微管蛋白及CRMP2的分布及表达通过直接及间接免疫荧光法检测细胞微管结构及T514位点磷酸化CRMP2的表达。(1)细胞传代后接种于预先放有盖玻片的6孔板内，每组2个副孔。每张玻片上接种细胞数约为2x104。 (2)培养24小时待细胞完全贴壁后，更换含有10pmolL全反式维甲酸(ATRA)培养液培养，诱导分化7天。(3)第8天弃去原培养液分别加入含O1和1I_tmolL聚集状态Apl_42培养液(含2胎牛血清)，对照组仅加入同体积含2胎牛血清的1640培养液。继续分别培养24小
8、时。(4)吸弃培养液，用预冷的PBS洗5分钟3次。(5)4多聚甲醛固定20分钟，PBS洗3分钟3次。(6)用025TritonX100通透处理10分钟，PBS洗3分钟3次(7)加入含10山羊血清的封闭液室温封闭30分钟；(8)加入混合后FITC标记兔抗Gt微管蛋白一抗(1：1000)和抗兔抗T514位点磷酸化CRMP2一抗(1：1000)，避光4“C孵育过夜，PBS洗5分钟3次。(9)加入TRITC标记鼠抗兔二抗(1：200)，避光室温孵育2小时。(10)PBS洗3分钟3次，用含防荧光淬灭剂的甘油封片。(1 1)荧光显微镜(Olympus BX51)40倍镜下观察，相机(ProgResCCD，
9、型号：Mfc001)拍照，Fish progress 30系统获取图相，图片使用Image Pro Plus 60软件分析。每张玻片随机取20个细胞，测量计算细胞平均荧光强度及分布面积。实验室同一条件下重复3次。12山东大学硕士学位论文6Westen blot法检测SHSY5Y细胞内T514位点磷酸化CRMP2的表达61蛋白样品制备(1)SHSY5Y细胞传代后接种于预先放有盖玻片的6孔板内培养。(2)细胞生长至70“-80汇合后，弃去原培养液分别加入含01和llamolL聚集状态Apl42培养液(含2胎牛血清)，对照组仅加入同体积含2胎牛血清的1640培养液。继续培养24小时。(3)倒掉培养液
10、，并6孔板倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。(4)每孔细胞加lrnl 4“C预冷的PBS(pH74)。平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操做，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养板置于冰上。(5)按lml裂解液加109lPMSF(100mmolL)，摇匀置于冰上。每孔细胞加t009l含PMSF的裂解液，于冰上来回摇动使细胞与裂解液充分接触，裂解20分钟。(6)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至15ml离心管中。(7)于4下12000rpm离心15分钟。将离心后的上清分装转移倒05分钟的离心管中放于20保存。62标本蛋白含量测定
11、蛋白标本含量测定方法参照BCA蛋白定量试剂盒(1)取08ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mgml的蛋白标准溶。(2)取适量25mgml蛋白标准，加入PBS稀释标准品，稀释至终浓度为05mgml。(3)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制适量BCA T作液，充分混匀。(4)将标准品按0，l，2，4，8，12，16，209l加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到201xl。(5)取对照组、O1和1lxmolLAlBl42处理组样品各5pl到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到201d。(6)各孔加入2009l BCA工作
12、液室温放置2小时。(7)用96孔板酶标仪(BIORAD Model 680型)于560nm的波长测定吸光光度值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。63 SDSPAGE电泳(1)清洗玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后晾干，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架山东大学硕士学位论文子上准备灌胶。(2)按前面方法配10分离胶，加入TEMED后摇匀灌胶。然后胶上加一层双蒸水，使胶凝的更快凝固。(3)分离胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配4的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出
13、。(4)用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(5)将定量测量后蛋白样品，按50p,g蛋白量取出上样样品至2001xl的EP管中，加入5xSDS上样缓冲液至终浓度为lX。(6)将样品于沸水中煮510分钟使蛋白变性。(7)电泳槽内加足够的电泳液后按每孔加样201tl开始准备上样。并加入蛋白marker。(8)在浓缩胶内恒压80V下电泳l小时；在分离胶恒压100V下电泳2小时。64转膜(1)转一张PVDF膜和6张滤纸，按胶的大小剪裁。预先在甲醇中浸泡15秒钟，蒸馏水中浸泡5分钟，转膜液中浸泡15分钟。(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑
14、的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒擀走里面的气泡。(3)小心的将玻璃板撬开剥胶。以加样孔及蛋白marker为标志将分离胶及浓缩胶轻轻刮去。小心剥下分离胶盖于滤纸上调整使其与滤纸对齐，擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上，并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行。(4)将夹子放入转移槽槽中，并倒满转移液。4“C冰箱内用50mA恒流转膜12小时。65免疫反应(1)PVDF膜从专辑槽中取出，按蛋白marker裁剪。(2)将膜放入含TBS平皿中，室温下摇床上洗5分钟3次。(3)5脱脂奶粉封闭液，室温下封闭1小时。TBST摇床上洗5分钟x3
15、次。(4)撕下适当大小的一块儿保鲜膜，对折后封闭3边形成袋状，放入PVDF膜，加入提前稀释的兔抗T514位点磷酸化CRMP2一抗(1：1000)和小鼠抗I)-actin一抗(1：1000)。抗体用含5脱脂奶粉的TBST稀释。封闭保鲜膜，摇匀后4“12孵育过夜。吸弃一抗，TBST摇床上洗5分钟3次。14山东大学硕士学位论文(5)同上方法分别准备过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗稀释液(1：1000)并与膜接触，室温下孵育l2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗2次，每次10分钟；再用TBS洗一次，10分钟，进行化学反应显色。66化学显色及图像分析(1)将PVDF膜放于平皿内，依次加入DAB
16、显色液及工作液。(2)室温避光孵育515分钟，直至显色至预期深浅。去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1“-2次即可终止显色反应。(3)吸水纸吸净蒸馏水，与扫描仪下(Canon公司LIEDl00)扫描图像。结果以p-actin为参照，应用Quantity one 462软件进行条带灰度分析。7统计学处理统计学分析采用SPSSl60进行，结果以均数加减标准差标示(X 4-s)，结果显著性检验采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差(LDS)t检验，p005表示差异有统计学意义。15山东大学硕士学位论文结果1全反式维甲酸对SHSY5Y细胞的诱导作用正常培养SHSY5Y细胞有神经母细胞瘤的细胞特
17、征：细胞体较小呈多角形，可伸出较短的轴突，有较少的胞质和树突样突起，且呈簇状生长。应用1 01maolL全反式维甲酸诱导后SHSY5Y细胞形态变化：细胞体收缩，细胞分裂减慢。诱导7天后可见：神经突伸长明显，形成一条或几条较长的轴突，细胞呈明显的极性。2MTT比色法分析结果应用聚集态Apl啦处理后能抑制细胞生长，实验证明抑制作用与浓度存在关系。以0110nmolL聚集态A13l越处理后细胞存活率出现变化，但与对照组比较无明显差异(p2005)。以01(100nm01)及1pmolL聚集态Apl啦处理SHSY5Y细胞时，可见细胞存活率显著降低(p001)(图1)。但01与llamolL聚集态Apl
18、42处理组之间比较无显著性差异(p-2_005)。为观察在影响生存状态的最小浓度下，聚集态Apl也对细胞结构与功能的影响，选取对细胞存在显著影响的01及19molL浓度进行下一步实验。3Apl42对细胞轴突生长状态的影响以10ItmolL全反式维甲酸诱导SHSY5Y细胞后7天，细胞形态明显改变，细胞增速度明减慢，形成一根或几根较长轴突，细胞呈显明显的极性(图2 B)。应用浓度为01和1rtmolL聚集态Apl啦处理后可发现部分细胞轴突回缩。通过甲苯胺蓝染色对轴突长度测量，统计结果显示：以01I-tmolL聚集态Apl也浓度处理诱导后SHSY5Y细胞24h后细胞轴突长度与对照组相比无明显缩减(脸
19、005)(图2 C，表1)；以ll：tmolL浓度聚集态ABl42处理处理24h后，细胞突起长度较对照组显著缩短(Po05)(图2 D，表1)。结果表明当浓度达到一定范围后聚集态Apl42可明显抑制细胞轴突的伸长。4免疫荧光分析A13l抛对细胞微管结构及细胞磷酸化CRMP2表达的影响荧光显微镜下镜下观察可见对照组细胞微管结构正常，绿色荧光(代表FITC标记a微管蛋白免疫阳性产物)在细胞核以外的胞体及突起内分布均匀(图3 A1)，红色荧光(代表TRITC标记的T514磷酸化CRMP2免疫阳性产物)主要分布于细胞体，而在突起部分红色荧光表达较弱(图3 a2)。应用浓度为01和11tmolL聚集态A
20、pl_42处理后低倍镜下观察可见细胞突起变短，高倍镜下观察可见部分微管网络结构模糊，部分塌陷，突起部分绿色荧光分布减低(图3 B1、C1)。处理组(O1和1tmolL)与对照组相比红色荧光在细胞体及突起部位显示均增强(图3 B2、16山东大学硕士学位论文C2)通过对比不同浓度处理组与对照组平均细胞内荧光分布面积及强度，统计结果显示：19molL聚集态Apl-42处理组与照组及019molL聚集态Apl电处理组相比，细胞内绿色荧光强度明显减低(p005)(表2)，但各组间细胞平均绿色荧光分布面积无显著差异(佗O05)。处理组(01和1lanolL)与对照组相比红色荧光在细胞体及突起部位显示均增强
21、，红色荧光分布面积扩大(pO05)，强调度增加(pO01)(表3)；l眦nolL与019molL聚集态Aplm处理组相比，红色荧光分布面积与强度均显著增加(p005)。结果显示随着聚集态Apl-42浓度的增JHTSl4磷酸化CRMP2在细胞内分布增加，表达增强，并对细胞正常微管结构产生影响。5Westen blot分析细胞内T514位点磷酸化CRMP2的表达Westen blot结果显示使用浓度为01和1xrnolL聚集态A3142处理SHSY5Y细胞后T514位点磷酸化CRMP2(分子量63kDa)表达量显著增加(po01)(图4，图5)。用1lmaolL聚集态A13j42处理与01lxmo
22、lL相比，T514位点磷酸化CRMP2表达量显著增JJfl(P005)(图4，图5)。实验结果显示细胞外使用聚集态Apl42处理，可使T514位点磷酸化CRMP2在细胞内表达量增加。同时随着聚集态Apl42处里浓度的增加，T514位点磷酸化CRMP2表达量也增加。这提示TAl3142可能通过磷酸化CRMP2影响其正常生理功能从而对神经细胞轴突及细胞微管结构与功能产生影响。17山东大学硕士学位论文讨论阿尔茨海默病(AlzhermerS Disease，AD)是由德国医生阿尔茨海默(Alois Alzheimer)最先描述而得名。1960年德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性痴呆表现
23、的51岁女性患者，该病人认知能力不断减退，病情逐渐恶化，4年半后死亡。患者死后病理检查显示：大脑皮层萎缩，神经原纤维缠结27,28】。于1910年把这种病命名为阿尔茨海默病128】。通过研究人们发现AD是导致痴呆的主要疾病。AD发病的首要危险因素就是年龄。对于65岁以上人口，年龄每增加5岁，发病率约增加一倍，在85岁以上人群中的发病率超过13【29】。随着人口老龄化社会的到来，AD的发病率不断上升，预计全球目前患病人数已达到3500万【101。AD已经成为老年人主要的致死性疾病之一。美国AD协会研究报告指出。目前，在美国AD已成为第六位的致死性疾病，而在65岁的老年人群中列第5位。随着医疗条件
24、的改善，在其他疾病死亡率不断下降的同时，AD的死亡率却不断上升。权威数据统计在美国从2000年到2008年心脏病的死亡率下降了13，脑卒中的死亡率下降了20，前列腺癌的死亡率下降了8，而AD的死亡率却上升了66。由于AD影响病人认知功能，患者往往生活难以自理，需要专人照料。据统计在美国就2010年约1500万家庭和志愿者花费在照料AD及其他痴呆病人身上的时间约为170亿小时，约合劳动价值为2020亿美元【3】。这些惊人的数字告诉我们，AD已成为重大健康问题，对家庭与社会都带来巨大负担。在我国虽然没有关于AD的详细统计报道，但通过人口学家指出发现我国21世纪上半叶人口老龄化的主要特征为：高速；高
25、龄；老人数量大；老年抚养比大；地区差异大。可以预计AD必将对我们的生活带来巨大的影响。因此找到疾病的有效防治措施极为重要。尽管AD在100多年前就被定义了，但对于这种疾病的症状、致病原因、发病风险和治疗直到近30年才通过研究获得一定的成果。虽然在AD的遗传机制的研究上有所突破，但AD致病原因和发病机制仍然不明确。AD的主要病理学表现为神经元外p淀粉样蛋白沉积形成老年斑和神经元内积聚过磷酸化多聚Tau蛋白。两者最终导致神经细胞缺失。在形态学上二者分别表现为老年斑(SP，senile plaques)和神经纤维缠结(NFT,neurofibrillarytangles)。通过研究人们发现老年斑和神
26、经纤维缠结是脑组织损伤的标志，而非造成AD发病的原因。而老年患者脑内神经细细胞长期代谢过程中产生的异常蛋白则可能是造成细胞功能障碍的主要起始环节。一、p淀粉样蛋白18山东大学硕士学位论文1AB的生成及其在AD中的作用目前通过对转基因动物模型的研究和生物化学分析已表明，A13在AD的发病过程中起着极为重要的作用。Ap由p淀粉前体蛋白(APP，b-amyloid precursor protein)经过p和丫分泌酶代谢产生。APP首先通过p分泌酶剪切，形成的较大片段为sAPPl3被释放到胞浆或细胞外。而与细胞膜连接的含99个氨基酸的片段(C99)又接着被丫分泌酶剪切，从而产生Ap68】。Ap由于剪
27、切位点的不同，生成含36到42个氨基酸残基，其中最多的是38，40和42个氨基酸的残基。尽管在体内Ap40含量最多，但我们最值得注意的却是A肛2。因为片段较长的A陋2更容易形成寡聚体，进而形成淀粉样蛋白纤维。在人体中Ap的表达是正常现象，然而当Ap表达过量或A1342的比例上升时则很有可能导致AD的发生【11】。已有许多证据支持AB在AD发生中起着重要作用。首先APP蛋白的基因位于2l号染色体上。而在唐氏综合症(Downs syndrome)患者脑内发现与AD相同的病理变化，并同时伴有APP表达量和AB含量的增多30,31。在少数唐氏综合症患者体内21号染色体末端编码APP部分基因缺失。这一类
28、患者没有出现痴呆症状，在死后尸检中也没有发现异常淀粉样蛋白的沉积【32】。第二，在体外细胞实验及动物实验中都已经证实，人工合成的Ap对海马及皮质神经元存在毒性作用3335】。第三，在编码APP的基因区域发生遗传性突变时，Ap的表达量增加并且在脑内聚集沉淀，这一人群出现早发型AD36，371。第四，众所周知早老素1和早老素2编码丫分泌酶的催化区。在出现早老素1和早老素2基因突变的病人中A1342AIM0的比例增加，并且导致早期快速进展性AD的发生【38391。第五，通过对表达人APP基因的转基因大鼠的研究发现，大鼠脑内A13表达量增加，同时产生神经病理改变和行为学改变ml。第六，在通过对高表达t
29、au蛋白转基因大鼠和同时高表达tau蛋白和APP基因突变的转基因大鼠研究发现，脑内注射人工合成AB是可造成过磷酸化tau蛋白增加，导致神经纤维缠结和其他AD的病理学改变H1421。这些研究同时表明Ap可以聚集成不同形式，从二聚体到最终形成p淀粉原纤维。不同形态的Ap在AD的发病过程中的作用也不尽相同。2AD寡聚体的细胞毒性作用A13有自发聚集倾向，容易聚集形成2“6个肽链的寡聚体，并可进一步联合，形成中间状态聚集体，再进一步聚集形成B淀粉原纤维m，441。p淀粉原纤维自发排列形成p折叠变为不容性纤维，进而形成淀粉样斑。Ap是人体正常代谢的产物，广泛存在于大脑和脑脊液中f45,461。因此单纯A
30、B的出现并不会导致神经系统变性疾病。而Ap分子的自发聚集作用可能导致神经细胞的损伤147。在AD患者脑内Ap可形成直径约为6到10nm的不溶性原纤19山东大学硕士学位论文维。在体外，人工合成的Ap也会形成同脑内一样的淀粉样蛋白的原纤维娜】。研究证明Ap的聚集作用对于其细胞毒性作用是不可或缺的。然而早期关于体外实验中Ap聚集状态的研究却非常有限，因为大多数观点认为当Ap聚集形成淀粉样原纤维后才能产生明显的细胞毒性。通过对AD病人的尸检发现，病人痴呆症状的严重程度与淀粉样原纤维形成的斑块在脑内的密度并无明显相关性【491。同时在对体外合成的AB，过表达APP的转基因细胞株，APP转基因大鼠和AD患
31、者脑脊液与大脑标本的研究过程中，越来越多的证据显示可溶性AB可能在发病过程中扮演重要的角色。在各种形态当中可溶性寡聚体状态A13细胞毒性最明显【1。通过对脑组织病理切片研究证明，AIS二聚体和三聚体对突触结构有明显的毒性作用【50】。患者认知功能减退的症状也主要与脑内Ap寡聚体的水平有关，而与总的Ap含量无明显关系【511。有研究证明神经元活化后通过类似神经递质释放的囊泡转运的过程将A13释放到突触间隙。病理状态下突触间隙内较高水平的AB可形成寡聚体抑制兴奋性神经递质的释放，并-JVA阻止细胞去极化152】。在本研究中通过参照国内外相关研究方法，在体外应用人工合成A13,-42制备聚集态A13
32、l也寡聚体。同时体外培养并诱导神经母细胞瘤SHSY5Y细胞，给予聚集态Apl42处理，构建Apl42对细胞的损伤模型。研究了聚集态Apl越对细胞微管结构及T514位点磷酸化CRMP2表达的影响。有报道指出微摩尔每升到纳摩尔每升的低浓度水平上可溶性A13寡聚体对细胞轴突及突出已存在明显毒性作用【53】；并且已有诸多体外细胞培养实验证实高浓度Ap寡聚体(10pmolL-1mmolL)对细胞毒性作用明显【541。通过对临床AD患者样本的分析显示，患者脑脊液内AISlm的浓度在纳摩尔每升水平f55J。考虑到AD易形成寡聚体在局部积累，脑组织内局部浓度应高于脑脊液水平。但国内外文献尚未见确切报道。在本研
33、究实验过程中，我们选取01nmolL1unolL的浓度范围，考察在符合体内环境的较小浓度条件下，ADl越对细胞存活率的影响。通过MTT实验发现以O1和10pmolL聚集态A13142处理，使细胞存活率显著降低。参照MTT结果，选取O1和101amolLA3F42研究对细胞突起状态、微管结构及信号转导途径的改变。本研根据MTT实验结果，选取011OpmolL水平聚集态ABl啦处理，目的是观察在对细胞生存的状态产生最小影响的低浓度条件下，ABl42对细胞突起状态、微管结构及信号转导途径的改变。本研究证明聚集状态Apl42对细胞微管结构存在明显影响，损伤神经细胞骨架结构，使细胞轴浆运输障碍，轴突回缩
34、。关于A8作用机制研究者提出诸多假说，包括引起突触缺失，炎性反应，电解质紊乱，氧化应激等，然而Ap的真正作用机制仍不清楚。近年来有研究显示Ap可增加tau蛋白过度磷酸化【411，这提示了Ap对细胞微管结构存在损害。山东大学硕士学位论文二、tau蛋白1tau蛋白的病理学特点神经纤维缠结是指神经锥体细胞内一种细丝状包含物。这种改变在AD及其他神经系统变性疾病中可以观察到。这一类疾病统称为tau蛋白病【561。神经纤维缠结的数量标志着AD病理学改变严重程度【56】。在神经细胞内这些细丝状缠结物的主要成分是异常磷酸化并聚集的tau蛋白。正常生理状态下，在神经细胞内存在大量可溶性tau蛋白。tau蛋白起
35、着促进轴突微管蛋白聚集，稳定微管结构和辅助囊泡转运的作用。过度磷酸化tau蛋白形成不可溶状态，与微管蛋白结合能力下降，易自发聚集形成双螺旋细丝状结构。tau的磷酸化作用受多种蛋白酶的调节，包括GSK3p，CDK5掣卯J。同AB寡聚体类似，可溶性中间聚集状态的异常tau分子细胞毒性作用最为明显，并且与认知功能的损害相关【5引。有证据表明当tau蛋白形成不可溶的双螺旋细丝状结构后失去病理活性作用。因为细胞轴突转运能力下降和神经元的缺失与总的神经纤维缠结的数量量并无明显相关关烈591。并且有研究显示tau蛋白形成的螺旋细丝状结构可以隔绝中间聚集状态tau蛋白的细胞毒性作用，研究者认为这一过程对细胞有
36、一定的保护作用60l。神经纤维缠结的的数量与神经元缺失的严重程度并不是成正相关，而脑脊液中可溶性磷酸化tau蛋白的总含量增加则会加速认知功能衰退【611。有研究显示通过检测有轻度认知障碍的早期AD患者脑脊液内一T181、T231位点磷酸化tau和总的磷酸化tau蛋白含量可以准确的预测疾病的发展及预后【62】。2AB促进tau蛋白磷酸化的发生目前还没有发现AD中tau蛋白基因存在突变。而诸多实验研究表明，Ap的聚集先于tau的聚集，并且可以促进tau蛋白聚集的过程【4l】。并且通过实验证实Ap所导致的体外培养神经元的退行性改变和AD大鼠的认知功能的改变，都必须在有自身产生的tau蛋白过度磷酸化的
37、基础上发生【63,64】。这些证据都提示，tau蛋白的过度磷酸化过程可能是A3积累所导致的细胞内的下游反应。Tau蛋白的磷酸化主要为丝氨酸苏氨酸位点的磷酸化的过程。研究显示在肽链最长的tau蛋白分子单体内有79个磷酸化位点【65】。而在AD疾病发生过程中至少有30个位点由两类蛋白激酶催化：一是脯氨酸激酶，包括eSK3p，CDK5等；另一类是非脯氨酸蛋白激酶，包括PKA，PKC等舐671。这些磷酸激酶调节tau与微管蛋白的结合。目前已通过大鼠AD模型证明：在以上的激酶中，CDK5和GSK33在AD疾病发生过程中起着调节tau蛋白异常磷酸化的重要作用。2l山东大学硕士学位论文在家族性AD的病例中存
38、在APP、PSI、PS2基因的突变。APP的高表达使913形成增加，而PSI和PS2基因所编码的蛋白是形成丫分泌酶的催化功能区的主要部分，可以促进APP剪切成为AB。目前被很多研究者接受的“淀粉样蛋白级联反应”学说认为，APP及PS等基因突变导致了Ap的积累。而Ap的积累能活化CDK5、GSK3等蛋白激酶，进而导致tau蛋白的异常磷酸化。Joao PLopes等【681研究证明，经Ap处理后体外培养神经元和AD大鼠模型内CDK5、GSK3活性均增高并且促进tau蛋白的磷酸化。Takashima,A等【691研究者已经通过体外培养大鼠海马神经元证明Ap的一部分片段A132535可以激活GSK31
39、3等蛋白激酶促进tau蛋白的磷酸化。以上证据表明在AD的发病过程中存在着Ap对一系列蛋白激酶的调节作用。从而导致tau蛋白的过度磷酸化，产生神经纤维缠结，并影响中枢神经细胞骨架结构、轴浆运输和突触的结构功能。这些提示我们在“淀粉样蛋白级联反应”过程中tau蛋白的磷酸化可能是下游细胞内重要的病理改变。但同时也能够发现：Ap能够引发细胞内信号转导通路的改变，进而导致多种蛋白激酶的活性改变，由于各种蛋白激酶催化底物是多样的，这种级联反应在细胞内的下游反应途径也不应该是单一的。换而言之，tau蛋白的异常磷酸化不应该是913引起细胞内病理改变的唯一机制。三、CRMP2与AD的关系CRMP2在哺乳动物CR
40、MP蛋白家族5种同系物中含量最多，同时也是研究最多的一种。CRMPS蛋白家族在神经发育过程中起着重要的作用，但只有CRMP2在成年后的神经元和少突胶质细胞内保持高表达水平【12，131。CRMP2(Collapsin response mediator protein2)又被称为类二氢嘧啶酶2(dihydropyrimidinaselike protein-2，DPYSL2)，是一种胞浆内蛋白，主要蛋白序列与催化尿嘧啶和胸腺嘧啶分解的二氢嘧啶酶(DPYS)同源【14J。CRMP2本身没有蛋白酶活性，但可以与细胞内其他成分结合发挥多种调节作用。其功能包括影响微管动力学结构、神经突的生长和回缩、神
41、经分化、轴突与树突的分化、驱动蛋白依赖性轴浆转运、Ca2+的平衡和神经递质的释放等【151刀。CRMP2由于选择性N末端剪切可以形成多种异构体，主要是CRMP2A(75la)和CRMP2B(6266kDa)170。CRMP2A主要在胚胎发育过程中表达，而CRMP2B主要在成人中枢系统内表达；CRMP2A主要表达在神经细胞体和轴突，而CRMP2B则主要分布于轴突和树突170j。不同CRMP2异构体的功能目前尚不清楚。本实验中Westen blot结果显示T514位点分子量为63kDa，主要识别CRMP2B。而在70kDa左右可稳定的出现一蛋白条带，考虑为部分异常磷酸化CRMP2A。关于CRMP2
42、不同亚型的表达情况及功能仍有待进一步研山东大学硕士学位论文究。CRMP2主要能够在微管的正端结合稳定微管蛋白，以此来促进轴突延伸。因此在体外神经细胞培养过程中通过增加CRMP2的表达，可使轴突普遍增长，并使细胞形成额外的轴突【71,72。虽然CRMP2与微管结合蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)一样有稳定微管结构的功能，但CRMP2在系统发生上区别于MAPs，并且功能更为多样，可以结合除了微管蛋白以外的其他蛋白物质。CRMP2与微管蛋白的相互作用不断受到各种形式的调节。在经典的CRMP2依赖的生长锥坍塌反应通路中，臂板蛋白3A(semaphorin
43、3A，Sema3A)信号通过其细胞膜受体神经菌毛素1(neuropilin-1，NP-1)和丛状蛋白A(plexinA，PlexAl-3)激活Racl，进而影响下游激酶，最终激活糖原合成激酶3D(glycogen synthasel(iI瑚e 3p，GSK3p)1121。GSK3p能够磷酸化CRMP2的509和514位点苏氨酸(T509，T514)。GSK3p磷酸化的必要条件是CRMP2已通过CDK5磷酸化522位点。Yoshimum,T等【19】已通过实验证明GSIOl3主要通过磷酸化T514位点使CRMP2失去与微管二聚体结合的能力，进而对细胞微管结构和功能产生影响。结合对tau蛋白磷酸化
44、的研究，可发现CDK5和GSK313在磷酸化调节过程中起着极为重要的作用。也有研究证明，通过溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid)活化Rho蛋白酶A(RhoA)可调节CRMP2介导的生长锥坍塌反应。RhoGTPase激活下游Rho激酶(ROCK)可使CRMP2T555位点磷酸化【73】。这一途径区别于0S聊Racl调节途径，同样可触发生长锥坍塌。值得注意的是，在研究tau蛋白过度磷酸化的过程中有证据显示Ap对GSK3IB、CDK5及ROCK存在调节作用25,74,75】。这提示了Ap可能通过os瞄13等磷酸激酶作用于CRMP2，进而损害细胞正常的微管结构与功能。本研究通过检测
45、T514位点磷酸化CRMP2在细胞内的分布及表达情况，证明细胞外聚集态A13l-42使细胞内T514位点磷酸化CRMP2的表达量增加，并影响细胞轴突的生长和微管结构。目前已有充分证据显示在体外细胞培养、AD动物实验以及AD患者脑内的淀粉样蛋白积累并不会使总CRMP2表达量明显增加。这些都充分表明了Ap可以触发细胞内“级联反应”引起CRMP2和tau蛋白等物质的过度磷酸化从而影响细胞正常的结构和生理功能。关于CRMP2在AD发病过程中的作用仍有待进一步研究。通过探讨CRMP2与AD中Ap导致的老年斑和tau蛋白磷酸化导致的NFTs等特征性病理改变的关系，可以帮助我们研究AD发病的机制，并为AD的
46、防治开拓新的途径。山东大学硕士学位论文结论二日 己1聚集态Apl-42可以抑制全反式维甲酸诱导的SH-SY5Y细胞的生长，使细胞存活率下降，且抑制作用与A13142浓度相关。2聚集态Apl42可以抑制全反式维甲酸诱导的SH-SY5Y细胞轴突的伸长。3聚集态Aplm可以通过使SHSY5Y细胞内T514位点磷酸化CRMP2表达量增加，影响CRMP2的正常功能，抑制微管聚集，损伤细胞正常结构和功能。这一机制表明CRMP2在AD的发病过程中存在重要作用。24山东大学硕士学位论文_一一一附表、附图存活率，、琴一图1MTT法检NAp心对细胞生长的抑制作用A131-42(n molL)(珏s，n=3)与对照
47、组相比po05，PO01山东大学硕士学位论文图2A B。吨对细胞轴突长度的影响(标R-so lI m)A正常SHSY5Y细胞BSHSY5Y经全反式维甲酸诱导7天(对照组)CO1 lamolL Apl42处理组D1岬。儿Apl-42处理组表1Apl-42对细胞轴突长度的影响分组 神经突长度(岬)对照组 655士23A131-42处理组(01 lxmolL) 593士27ABl42处理组(1 ttmolL) 5384-28宰结果以-士s表示，n=6；与对照组比较，pO05， pO0126山东大学硕士学位论文图3免疫荧光检测微管结构和T514位点磷酸化CRMP2 I拘表达(标尺=20 lara)A对
48、照组 B01lnnolL Apl-42处理组C1lamolL Apl42处理组1细胞内微管蛋白表达情况2细胞I内T514位点磷酸化CRMP2表达情况3免疫荧光双标图像(绿色荧光：FITC标记a微管蛋白免疫阳性产物；红色荧光：TRITC标记T514位点磷酸化CRMP2免疫阳性产物)山东大学硕士学位论文一 一-二一表2Ap2对SHSY5Y细胞微管的影响对照组 (656圭204)103 14208士3320ApH2处理组(01lunolL)(651士177)X 103 13835士3080Apl_42处理组(1IJmolL) (574j：257)X 103 11241士3079结果以聂s表示，n-6；与对照组相比幸p005，p001表3Ap他对SHSY5Y细胞内T514位点磷酸化CRMP2表达的影响分组 荧光面积(pixels) 荧光强度对照组 (240士O71)1 03 278 1士1437Apl垃处理组(01molL) (431士119)10h 5253士1930Apl-4
