1、分类号：Q291密级：公开浠却乒雩单位代码：10427学 号：2011010469硕士学位论文Apert综合征致病基因FGFR2E731K突变对成骨细胞分化及IyIWs矿化能力的影响研究生姓名导师姓名学科(领域)所在学 院申请学位级别答辩时 间刘振兴崔亚洲微生物与生化药学济皇三，差医学与生命科学学院山东省医学科学院 一一一医学硕士2014年5月Apert Syndrome Disease Gene FGFR2E73 1K MutationOn Osteoblast Differentiation And MVs MineralizationZhenxing LiuUnder the Super
2、vision ofProfYazhou CuiIfillf i ll IJlr lI Prl l Jll llllllllllIY2570208A Thesis Submitted to the University of JinanIn Partial Fulfillment of the RequirementsFor the Degree of Master of MedcineUniversity of JinanJinan，Shandong，PRChinaMay,2014导师简介：崔亚洲，男，1972年6月出生，辽宁朝阳市人，博士，研究员，硕士生导师。2003年06月毕业于山东大学，
3、获医学博士学位。学术兼职：任山东生物化学与分子生物学学会常务理事兼副秘书长、山东省罕见疾病防治协会常务理事兼秘书长、(Intractable&Rare Diseases Research)编委、中华肿瘤防治杂志编委、罕少见病杂志编委。一直致力于疾病的功能基因组学研究，主要研究方向是蛋白质组学，包括蛋白质表达谱的定量分析、蛋白质相互作用等方法及应用研究。通过建立基于DIGE技术的定量蛋白质组学技术平台，针对胰腺癌等疾病，筛选新的疾病蛋白标志物、药物靶点，并对其功能进行研究。研究方向：1、蛋白质组学；2、骨分子生物学。课题组成员：韩金祥，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事骨分子生物学、罕少见病
4、、人体电磁辐射等医学生物技术领域的研究。鲁艳芹，女，博士，副研究员，主要从事病毒学、骨分子生物学和成骨不全等方面研究。周小艳，女，硕士，助理研究员，主要从事骨分子生物学和罕少见病方面的研究。原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名： 半 日 期：关于学位论文使用授权的声明本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关
5、部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。必开一口保密( 年，解密后应遵守此规定)论文作者签名：华导师签名：聋塞红生二日期：竺必济南大学颂I：学位论文目 录摘 要IIIABSTRACT主要符号表一前 。言。1日U 昌l Apert综合征一111概述112 Apert综合征的发病机制。113 FGFR基因家族214 FGFI毪基因E731K突变32基质小泡421概述422基质小泡与矿化5 第一章Saos2细胞中FGFI也基因突变位点的检测71材料与方法7
6、11材料712方法82结果1 13讨论l 2第二章FGFR2及FGFR2E731K慢病毒载体的构建和在Saos2细胞中的转染与筛选1 31材料与方法1 311材料1312方法142结果1921定点突变结果1922稳定转染结果l 93讨仑20第三章转染后Saos2细胞的矿化相关指标的检测23l材料与方法2411材料24Apert综合征致病基因FGFR2E73 I K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响12方法262结果302，1转染后Saos2细胞矿化能力的检测结果3022成骨分化相关基因表达的检测结果。3l3讨论32第四章转染后Saos2细胞MVs的矿化能力的检测。341材料与方法3411
7、材料3412方法352结果3921 MVs的鉴定结果3922 MVs矿化能力检测结果403讨论41参考文献42附 录，45综述j46在校期间发表论文50致谢5 1济南大学硕士学位论文Apert综合征致病基因FGFR2E731K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响专业：微生物与生化药学研究生：刘振兴导师：崔亚洲摘要成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)家族有4种酪氨酸激酶家族成员(FGFRl4)，他们可与22种FGFs配体形成二聚体激活PLCY、Ras瓜甜MEl汜RK、RJAKSTAT等下游信号通路，在骨的形成、血管形成、神
8、经形成、损伤修复、肿瘤形成等方面起重要作用。其中FGFR2在某些肿瘤、皮肤、骨骼等疾病的产生过程中起关键作用，FGFR2多种突变可以导致一种骨罕见疾病一Apert综合征的发生。Apert综合征(Apert Syndrome，AS)又称I型尖头并指(趾)综合征(acroocephalo syyndactyly)，是颅缝早闭(Craniosynostosis)类疾病当中最严重的一种，是一种罕见疾病，新生儿发病率在1160，000与165，000之间。1906年，Apert首次对其进行了报道，属于常染色体显性疾病，是由FGFR2基因突变引起的，并且该病忠儿多为散发患者，由新生突变引起。其主要症状为尖
9、头、短头、面中部发育不良及并指(趾)畸形等。最近Park等在对一名Apert病人的研究中发现了FGFR2基因的一种新的突变类型，即E731K突变。对这新的突变的初步研究中发现，在没有FGF配体结合的情况下，FGFR2激酶能够发生自身磷酸化激活ERKMAP通路。Apert综合征是一种典型的单基因单位点突变引起的遗传疾病，对于研究骨矿化异常引起的疾病是一个良好的模型，在对很多骨矿化方面的研究中体外实验得到的结果很多时候不能在体内得到验证，是因为体内和体外环境有很大差异，而对于这一疾病模型的研究中我们只要得到FGFR2的致病突变则会使体外实验模型发生矿化异常，减少环境差异对实验结果的影响。为了进一步
10、研究FGFR2基因E731K突变导致Apert综合征的原因以及更进一步的阐述FGFR2E731K突IIIApert综合征致病基因FGFR2E73 1K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响变对成骨细胞基质小泡(matrix vesicles，s)的矿化能力影响，我们设计了以下实验。目的：本研究旨在阐述引起Apert综合征的FGFR2E731K突变在体外影响成骨细胞矿化的机制以及这种机制与基质小泡(matrix vesicles，MVs)之间的关系以及对MVs的影响，为进一步研究FGFR2基因的功能和MVs与疾病的联系提供一种新思路。方法：本研究拟采用人骨肉瘤细胞系Saos2，通过将FGFR2
11、(fibroblastgrowth factor receptor 2，FGFR2)基因的野生型和FGFR2E731K突变用慢病毒载体转入Saos2细胞中进行过表达来检测FGFR2E731K突变对成骨细胞矿化和MVs矿化的影响。本研究拟采用外显子测序的方法首先排除Saos2细胞中原本表达的FGFR2基因有无功能性突变位点，然后对慢病毒转染之后的MT(突变型FGFR2E731K)细胞和WT(野生型FGFR2细胞)用13磷酸甘油和抗坏血酸诱导后，检测其碱性磷酸酶(ALP)活性并用茜素红染色的方法检测两种细胞的矿化能力，同时用荧光定量PCR的方法检测两种细胞中矿化标志蛋白ALP、Runx2、OCN、
12、CollAl的mRNA水平表达情况来研究FGFR2E731K突变在细胞水平上对成骨细胞矿化的影响。然后采用ExoQiuck试剂提取两种细胞的MVs，检测其ALP活性和用吸光度检测其矿化悬液的浑浊度的方法检测其矿化能力，来研究FGFR2E731K突变对MVs的矿化活性的影响。结果：(1)测序证明Saos2细胞FGFR2基因外显子中没有功能突变位点，可以进行突变功能研究。(2)ALP和茜素红实验均发现MT(突变型FGFR2E731K)细胞和WT(野生型FGFR2)细胞在抗坏血酸和13磷酸甘油的诱导下，MT细胞的ALP活性和矿化结节数均明显高于WT细胞。(3)荧光定量PCR的实验结果表明，ALP、R
13、unx2、OCN、CollAl这四种矿化标志基因在MT细胞中比在WT细胞中有明显的表达上调。(4)MVs的ALP活性检测结果和吸光度实验表明，相较于WT细胞中提取的MVs，MT细胞中提取的MVs有着更高的ALP活性，在相同时间内产生的羟基磷灰石(HA)也更多。结论：本研究显示FGFR2E731K基因突变能使成骨细胞拥有更强的矿化能力并且能上调矿化标志基因ALP、Runx2、OCN、CollAl的表达，说明这一突变位点是一个功能获得型突变。在对MVs的研究中显示，FGFR2E731K基因能IV济南大学硕士学位论文明显增强MVs的矿化能力，这表明FGFR2E731K突变有可能是通过影响MVs的活性
14、来影响成骨细胞矿化的，同时也能说明FGFR2膜蛋白所引导的下游信号通路能影响MVs的活性。关键词：Apert综合征， FGFR2E731K，基因突变，基质小泡，矿化VApert综合征致病基因FGFR2E731K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响Apert Syndrome Disease Gene FGFI也E73 1KMutation On Osteoblast Differentiation And MVsMineralizationMajor：Microbiol and Biochemical PharmacyGraduate student：Zhenxing LiuSupervi
15、sor：Yazhou CuiABSTRACTFibroblast growth factor receptors(FGFRs)family has four tyrosine l(inasemembers(FGFRl-4)，they can form dimmers with 22 kinds of FGFs ligands toactivate PLC_T，RasRafMEKERK，RJAKSTAT pathwaysThey play an importantrole in bone formation，blood vessel formation,neurogenesis，damage r
16、epair and intumor formationFGFR2 multiple mutations Can lead to a rare bone diseaseApertsyndromeApert syndrome(AS)，also known aus acroocephalo syyndactyly which isone of the most serious type of Crartiosynostosis and is a rare disease，neonatalmorbidity between 1160，000 and 165，000In 1906，Apert repor
17、ted it for the firsttime，Apert syndrome belongs to the autosomal dominant disease and caused byFGFR2 gene mutations，children with this disease is Distributed，caused by newmutationsRecently,Park and others found a new mutation of FGFR2 gene in thestudy of an Apert patients，E73 1 KIn the preliminary s
18、tudy of this new mutation，they found in the absence of FGF ligand binding FGFR2 kinase itself Can occurphosphorylation to activate ERK-MAP pathwayApert syndrome is a kind oftypical Single-genesingle-point-mutation caused genetic diseaseIt is a good modelfor the study of diseases caused by abnormal o
19、f bone mineralizationAs there is abig difference between in vitro and in vivo environment，the results of many studiesin the aspect of bone mineralization in vitro Call not be obtained in many cases invivo validationIn the research on this disease model，We just need to get FGFR2VI济南大学硕士学位论文pathogenic
20、 mutations that can make in vitro experimental model Occurmineralization anomalies to reduce the impact of environmental differences on theexperimental resultsTo further investigate the causes of Apert syndrome and furtherelaborated the roles of FGFR2 gene in bone formation and elaborate howFGFR2E73
21、 1 K affect matrix vesicles(MVs)mineralization，we designed thefollowing experimentObjective：This study aims to elaboratehow the causative gene mutation inApert syndrome，FGFR2E73 1 K mutation，affect osteoblast mineralization in vitroand affect MVs mineralization in able to provide a new idea for furt
22、her study thefunction of FGFR2 gene and to know the relationship between MVs andMineralization anomalied DiseasesMethods：In this study,we used human osteosarcoma cell line Saos一2 as ourcellsFGFR2E73 1 K mtation and FGFR2 gene Wild-type are transferred into Saos2cells by Lentiviral vectors to detect
23、how FGFR2E73 1 K mutations affect osteoblastmineralization and IVIVs mineralizationFirst，we used the method of sequencingexon to exclusion the functional mutations of FGFR2 gene、航tll Saos-2 cellsThenafter MT(mutant FGFR2E73 1 K)cells and WT(wildtype FGFR2 cells)inducedwith 13-glycerophosphate and as
24、corbic acid，we examined their alkaline phosphatase(ALP)activity and examined their ability of mineralization by Alizarin red stainingAt the same time we examined the mRNA levels of mineralization marker proteinsALP、Runx2、OCN、Col l A 1 by Quantitative PeR in two type of cellsWe extractedVlWs in two t
25、ype of cells by ExoQiuck reagents，and we detected their ALP activityand detected their ability of mineralization by Absorbance detectionResults：(1)Sequencing detection proved that FGFR2 gene exons of Saos2 cellhave no function mutations(2)We found that in the induction of ascorbic acid andB-glycerol
26、 phosphate，the ALP activity and mineralization ability were elevatedby the overexpression of FGFR2E73 1K(3)ALP、Runx2、OCN、CollAl mRNAlevels were elevated by the overexpression by the overexpression of FGFR2E73 1 K。(4)The ALP activity and mineralization ability ofVlWs were elevated by theoverexpressio
27、n of FGFR2E73 1 KVIIApert综合征致病基因FGFR2E73 1K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响Conclusion：This study shows that FGFR2E73 I K mutation can enhanceosteoblast mineralization ability and upregulate the expression of ALP,Runx2，OCN，CollAlIn the study of MVs，FGFR2E73 1K mutation Can significantly enhancemineralization abi
28、lity of MVs which may suggest that FGFR2E73 1 K mutation effectosteoblasts mineralization by MVs，and it also suggest that FGFR2 Can Regulate theactivity of MVsKey words：Apert syndrome，FGFR2E73 1K，gene mutation，matrix vesicles，mineralizationVIII济南大学硕士学位论文主要符号表济南大学硕士学位论文1 Apert综合征11概述1-J-刖 吾Apert综合征(A
29、pert syndrome，AS)又称尖头并指综合征I型(acrocephalosyndactyly)，与Crouzon综合征和Pfeiffer综合征为等位基因病，并且是膜内骨形成紊乱导致颅缝闭合异常疾病中最严重的一种。这种疾病比较罕见，Eugene Apert于1906年对其首次进行了报道，目前认为其属常染色体显性遗传疾病。出生时即发病，新生儿发病率约为1160，000到165，00011。Apert综合征的畸形不仅发生在颅面部，而且涉及四肢。以尖头、短头、面中部发育不良及并指(趾)畸形为特征，并指(趾)畸形常发生在第2、3、4指(趾)。婴儿时期前额部明显扁平和后倾，前囟膨凸，眼眶距增宽且眼
30、眶水平轴线外侧向下倾斜。Apert综合征患者偶有痤疮、腭部牙弓黏膜下隐裂、动眼神经麻痹、不对称的突眼和睑下垂等症状。还可并发中枢神经系统异常，严重者有颅内压升高的相应症状。其他症状有低位耳、脊柱裂、关节粘连、心血管系统异常等。颅缝早闭还会影响患者大脑发育，一般表现为正常或轻度智力缺陷，少数患者还会有多指畸形2】。12 Apert综合征的发病机制Apert综合征是由位于染色体10q26上的FGFR2(fibroblast growth factorreceptor 2)基因突变引起的。FGFR2可翻译生成两个亚型：FGFR2IIIB和FGFR2IIIC，两者的表达模式不同，前者主要在皮肤发育中表
31、达，而后者主要在骨形成中起作用【l】。该病患儿的父母年龄偏大，且多为散发患者，由新生突变引起。Moloney5】等发现55例Apert综合征患者的突变体等位基因都是父源性的，且受父本年龄影响，但这种父本年龄影响在不同突变中不同，$252W突变受父本年龄因素影响较大，而P253R突变受父本年龄影响较小。这可能与$252W突变处包含CpG二核苷酸有关，而研究表明CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基易发生突变。ipert综合征致病基因FGFR2E73 1K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响Du 17J等采用基因敲入的方法，将发生Pr0253Arg突变的ipert综合征患者FGFR2基因镶嵌至小鼠体内构
32、造小鼠模型Fgfr2(+P253R)。与野生型相比，突变体小鼠下颌骨发育畸形，鼻骨、颧骨以及颅骨的部分区域都存在异常，与人Apert综合征特征性颅骨形态相似，说明Fgfr2(+P253R)Jx鼠是hpert综合征一个良好的模型。形态学上的变化研究有助于阐明FGFR2基因突变导致颅面异常，引发Apert综合征的机制。201 1年Nagatal8】等为研究Apert综合征患者颅底部软骨生长情况建立了Apert综合征样突变小鼠模型Fgfr2IIIC(P253R)，发现小鼠颅底Sox9和Runx2及p21、lhh、Mmp13表达升高，继而软骨细胞肥大加快，研究发现突变后的FGFR2IIIC(P253R
33、)与FGF2FGFl0的亲和力增强，FGF2FGFl0信号增强。因此Nagata等认为Apert综合征患者出现尖头样的原因是由于颅底过早的出现软骨内成骨所致。13 FGFR基因家族成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth FactorsReceptors，FGFRs)是一类酪氨酸激酶受体，有跨膜结构。它们与FGF配体特异性结合将信号由胞外传入细胞质当中去。目前，成纤维细胞生长因子受体已经确定了有4种即FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4，它们是由4种独立基因编码的【90l。FGFRs均为单链的糖蛋白分子，它们的结构包括3个部分：细胞外区的3个免疫球蛋白样结构域(I)
34、、穿膜螺旋即为跨膜区和细胞内的酪酸激酶区。这4种FGFRs具有很高的氨基酸一致性和基因同源性【lOl，它们之间的区别为对配体的亲和力不同和在体内表达分布的位置不同。FGF配体主要与免疫球蛋白样和间的环内区、区的N端有关。而对于配体的特异性识别则由区的C端来决定【l引。在3个免疫求蛋白结构域中结构域、II区在于配体的结合中有关键作用并且他们的氨基酸序列有高度的保守性，而I区氨基酸序列的保守性则较低，很多人认为它与配体结合无关。FGFRs有3个特点：第一、有多特异性并且可以重叠识别，即一种受体能和几种FGF相结合它们之间有相似的亲和性，而相同的同一种FGF也可以和几种不同的FGFR受体相结合；第二
35、、细胞表面的硫酸肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycans，HsPG)在FGF配体和FGFR受体的结合过程中起着重要的作用；第三、多种细胞结合性和分泌性受体可以来自同一种基因，2济南大学硕士学位论文即FGFRs有多种转录副本，但它们具体的形成方式有些不一样，有一部分是在mRNA转录的过程中通过可变剪接所产生的，有些是在转录和翻译之后在细胞表面由酶水解而成的，这些异构型通常缺少免疫球蛋白样结构域I，并且在免疫球蛋白样结构域III的序列的后半部分存在变化。它们的作用是调节受体与配体的亲和能力，这是由不同的异构体之间的竞争来实现的【11】。14 FGFI也基因E731K
36、突变FGFR2是免疫球蛋白样酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成员中的一种，FGFR2由3个部分组成：即胞外的3个Ig样环状结构、跨膜区、胞内的酪氨酸激酶区。由于FGFR2基因中的第8和第9号外显子在剪接的时候只能二选其一，因此在C端部分，有7、8或7、9两种外显子的剪接形式，使FGFR2受体在经过剪接后出现两种亚型且JIIIB型或IIIC型。IIIB型主要存在与上皮细胞中，它与FGF310特异性结合，而IIIC则主要在间充质细胞内发生表达，它与FGF2、4、6、8、9结合19J。FGFI也的的突变类型以错义突变为主，并且这些突变主要分布在第2个和第
37、3个Ig样球蛋白之间以及第3个Ig样球蛋白上。FGFR2的这些突变表型均以囟门早闭为主，包括Apert、Crouzon、Pfeifer、JacksonWeissBeareStevenson综合征。这其中最常见的引起Apert综合征的突变有$252W和$252F等，FGFR2发生单碱基突变之后，通过引起它们所编码的蛋白质的改变来产生病变的。突变主要集中在细胞膜外的第2和第3个球蛋白之间或第3个球蛋白之上，对于在这一区域的突变的具体机制的研究目前主要有两种解释：其一，有一些点突变可以使细胞外第3个Ig区域产生未配对的半胱氨酸残基，从而引起两个受体之间以游离的半胱氨酸残基通过二硫键连接起来，形成并激
38、活不依赖配体的受体二聚体；其二，另一些点突变引起FGFR2配体和一些FGF受体的亲和力发生改变，使已激活的受体配体二聚体不容易分离，从而导致受体的功能的改变。由于膜外区域的活性发生改变从而引起膜内的酪氨酸激酶区活性改变，从而进一步影响下游的一些信号通路，例如PLC-?通路、 Ras瓜a价征科ERK通路、RJAKSTAT通路等【13J。2012年，Jounghyen Park161等人在对Apert病人的基因研究中发现了位于酪Apeft综合征致病基因FGFR2E73 1K突变对成骨细胞分化及MV$矿化能力的影响氨酸激酶区的E731K突变，并对这一突变进行了初步的研究，发现它有以下特点：OE73
39、1 K突变与其周边序列为高度保守序列，这提示这一区域可能对FGFR2的功能起关键作用；(窑)FGFR2E731K即使在FGF配体缺席的情况下也能使自身磷酸化活性显著增强：FGFR2E731K在没有配体刺激下激活ERKMAP通路；FGFR2E731K突变导致Runx2和ALP矿化相关基因表达上调；适)FGFR2E731K突变能促进成骨细胞增殖。因此，这一区域是FGFR2的重要功能区域，对这一突变位点的研究不仅可以阐述这一新的突变位点导致Apert综合征的机理，也能进一步了解FGFI也基因的在信号传导中的作用机制。2基质小泡21概述基质小泡(matrix vesicles，Mvs)是一种位于细胞基
40、质中的直径从几十纳米到200纳米不等的囊泡状结构，MVs选择性分布于软骨、骨和牙本质初始矿化位点。MVs形成于3种细胞的质膜即软骨细胞、成骨细胞和成牙质细胞，它们都是矿物形成细胞，但其膜组分的分布比例与起源细胞质膜不同。相对于细胞质膜，MVs中酸性磷脂的增加可能与MVs的矿化作用有关。在MVs中富含大量的蛋白质，这些蛋白大多与钙磷结合和矿物形成密切相关，主要包括钙磷脂结合蛋白(Annexin)、1I型Na+P043-协同转运蛋白及磷酸氨基乙醇一磷酸胆碱磷酸酶(PHOSPHO 1)N矿K+三磷酸腺苷(ATP)酶、组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)、整合素(integrin)、基质金属蛋白酶(ma
41、trix metaUoproteinases)、核苷酸焦磷酸酶磷酸二醋酶I(NPPl)、钙结合蛋白D9k(Calbmdm-D9k)。1VIVs的膜特征是能够与钙磷脂结合蛋白(annexins)、钙离子结合，使得大量的钙离子进入MVs。22基质小泡与矿化基质小泡(mamx vesicles，MVs)介导的矿化机制可能有三种：MVs释放启动矿物形成的可溶性离子，TNAP水解PPi得到Pi，钙离子和磷酸根在有机大分子(主要为胶原)上沉积；钙离子通过annexin通道、磷酸根通过III型钠离子依赖的磷酸根转运体进入s，矿物晶体首先在MVs中形成，而后离开4济南大学硕士学位论文MVs，进入胶原纤维中，并
42、进一步生长；第三种机制与第二种相似，不同点在于IWs可与胶原结合从而使得MVs中的矿物晶体能够更容易的进入胶原纤维中124|。争议点在于成核作用如何发生的，一部分学者认为MVs是成核的最初位点，另外一些学者则认为胶原、磷蛋白、磷脂类、脂蛋白类等大分子为成核的最初位点。目前普遍接受的为第三种机制，根据该机制骨基质的矿化过程可以分为两个阶段，第一阶段是针状的矿物晶体在MVs中的形成，Ca2+和P043在MV中积累到足够量，首先形成非晶体的CAP04沉淀(amorphous CAP04，ACP)，ACP转变为磷酸八钙(octacalcium phosphate)，最后转变为高度难溶的羟磷灰石(hyd
43、roxyapatite，HA)；第二阶段是矿物晶体穿透MVs到细胞外，与胶原蛋白连接，继而在细胞外环境的控制下不断生长。221基质小泡与矿化MVs分布在骨、软骨、牙质的基质中，在电镜下，其直径为50250nm。MWs富含有膜整合胞外酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和核苷酸焦磷酸磷酸二酯酶(nucleotide pyrophqosphatase phosphodiesterase，NPPlPC1)，含有磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)富集的膜表面。其膜特征是能够与钙磷脂结合蛋白(annexins)、钙离子结合，使得大量的钙离子进入MVs2
44、51。研究显示MWs起源于矿物形成细胞(软骨细胞、成骨细胞与成牙质细胞)的质膜，但其膜组分的分布比例与起源细胞质膜不同。相对于细胞质膜，MVs中酸性磷脂的增加可能与M-Vs的矿化作用有关，Boyan等提出MVs脂类可能作为羟磷灰石形成的成核位点。后期的研究提出s的磷酸脂类、Ca2+、P043一以及s的某些蛋白形成一种分子结构，磷灰石在此结构上结晶，这种分子结构称为“成核中心复合体”【261。222晶体穿透MV膜矿物晶体首先在MVs中形成，而后穿透MWs的膜到达胞外，那么，矿物晶体是怎样穿透MVs膜的?有研究发现，体外SCL(synthetic cartilage lymph)诱导MVs中的矿物晶体形成过程中，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)水平都迅速下降，并伴随游离Apert综合征致病基因FGFR2E73 1K突变对成骨细胞分化及MVs矿化能力的影响脂肪酸(free fatty acids)的积累，该研究提出这些膜脂的降解有助于矿物晶体排出MVs。另外，一部分PE转变为PS，促进了矿物晶体的形成。Mvs矿化的另外一个重要特征是鞘磷脂(sphingomyelin，SPH)的消失，经典的鞘磷
