1、重庆医科大学博士研究生学位论文Apel in在多囊卵巢综合征中的表达及对颗粒细胞作用机制的初步探讨中文摘要多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，pcos)是生育期女性常见的一种内分泌紊乱伴代谢异常疾病，发病率410，以稀发排卵或持续无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗(IR)和卵巢多囊样改变为特征。PCOS患者近期表现为月经失调、不孕、多毛、痤疮、肥胖，远期心血管疾病、糖尿病、肿瘤发生风险明显增高，PCOS严重威胁患者的生理及心理健康。生育期PCOS女性排卵异常是月经稀发或闭经、不孕的最主要原因。研究PCOS患者卵泡发育，有利于了解其生理病理改变及其可能的发病机制。P
2、COS患者卵巢内的始基卵泡数量与正常健康妇女比较无明显差异，而窦状卵泡、闭锁卵泡数量明显增多，无优势卵泡发育，导致排卵障碍，影响月经、妊娠及妊娠结局等。有学者提出PCOS是原发性卵泡病，而颗粒细胞的增殖、凋亡是卵泡发育及闭锁的根本原因，研究发现卵巢局部众多细胞因子通过旁分泌或者自分泌等方式参与颗粒细胞增殖或凋亡。无排卵PCOS患者改变生活方式后，排卵恢复者的体重、腹部脂肪减少比未恢复者更明显；此外PCOS患者内脏脂肪持续减少与排卵恢复紧密相关。可见肥胖及IR相关脂肪因子在PCOS患者卵泡发育中本课题受重庆市卫生局医学科研重点项目资助(编号：201卜卜003)重庆医科大学博士研究生学位论文有重要
3、影响，近年大量国内外研究侧重于探讨脂肪因子如脂联素、瘦素等在PCOS患者基因表达和(或)蛋白功能缺陷对脂、糖代谢影响，而对各种脂肪因子对PCOS患者卵泡发育微环境影响研究较少。Apelin为孤独G蛋白偶联受体血管紧张素II受体1相关的受体蛋白APJ的天然配体，apelin广泛分布于脑、胃、心、肺、肾、乳腺、子宫和卵巢等组织，参与血管平滑肌细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等细胞增殖与分化调节。2005年研究发现鼠、人类皮下组织的脂肪细胞可分泌apelin，作为新发现的脂肪因子，诸多研究发现apelin参与IR相关的代谢综合征疾病，如肥胖、2型糖尿病、原发性高血压、PCOS等发病。有关apelin与P
4、COS发病研究中，王芳发现PCOS患者apelin水平显著高于对照者，apelin水平与BMI、腰围、Ins和HOMAIR成正相关，BMI是影响血清apelin水平的独立相关因素；而G0ren发现PCOS患者血清apelin水平升高与临床特征及生化指标之间无相关性；Chang发现PCOS患者血清apelin水平与对照组比较明显降低，并与载脂蛋白A负相关，可能参与远期心血管疾病发生。目前apelin与PCOS的研究处于初期阶段，但所有的研究表明，apelin可能参与PCOS发病，其具体作用机制有待研究。本研究通过检测PCOS患者血清apelin的表达，探讨其与患者脂、糖代谢和性激素之间的相关性；
5、研究PCOS大鼠卵巢apelinAPJ表达情况和apelin对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞影响，以进一步探索PCOS复杂的发病机制。本研究共分如下四部分：第一部分：pel in毛E多囊卵巢综合征患者血清中的表达及意义目的检测PCOS患者血清apelin水平及与脂、糖代谢及性激素相4重庆医科大学博士研究生学位论文关性。方法采用化学发光法检测50名PCOS患者及20名健康对照者空腹血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平；采取磁酶免疫法测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、催乳素(RPL
6、)、睾酮(T)的血清浓度；采用酶联免疫法测受试验者血清apelin水平。结果(1)PCOS患者WHR084(O08)、BMI2288(315)kgm2、T066(O35)ngm1)、Ins907(827)叫IIll】、LH990(585)mlUml】、HOMA-IR193(180)】与健康对照组WHR079(O05)】、BMI(1988(295)kgm2】、TO29(023)ngm1、Ins598(302)uun：11、LH345(288)mIUml、HOMAIR126(143)】比较，差异均有统计学意义(PO05)；实验组大鼠卵巢重(7987+1634)g与对照组(9113+2195)g比较
7、，低于对照组，差异无统计学意义(P005)；实验组大鼠卵巢体重(O67+017)与对照组(O57i006)比较，差异有统计学意义(PO05)。(3)实验组卵巢组织HE染色见卵巢内有较多的早期发育小卵泡和未及时闭锁的囊状大卵泡，少见黄体，形成典型的多囊样改变卵巢，对照组卵巢内有不同阶段卵泡发育，可见黄体，无明显扩张的囊状卵泡。(4)免疫组织化学染色发现apelinAPJ分别表达于大鼠卵泡膜细胞、颗粒细胞中；实验组卵泡apelin蛋白表达的平均灰度值(62316+1458)，对照组卵泡apelin6重庆医科大学博士研究生学位论文蛋白表达平均灰度值(16619-+-1006)，apelin在实验组表
8、达量明显高于对照组(P25kgm2and BMI_25kgm2and BMI25kgm2 patients，the BMI005)，however，the ovarian weightbody weight ofmodel group was higher than that ofcontrol group(P005)(3)There were some early development of little follicles and theabundance ofsubcaplular ovarian cyst in ovary ofmodel group，which wastypical
9、 polycystic ovary morphous，while some different development offollicles and corpus luteum were detected in ovary of control group，without subcaplular ovariancyst(4)Immunostaining of apelin and APJ inthe granulosa cells and theca cells of PCOS ratS ovaries were obviouslystronger than that of normal c
10、ontrol(P，25kgm2组和BMI一25kgm2组与BMI一25kgm2组TG、HOMAIR高于BMI25kgm2组(P005)，HDL水平低于BMI25kgm2组(P005)。以上结果说明，与健康对照者比较，PCOS患者存在肥胖、IR、高T、LH，并在一定程度导致机体脂、糖代谢改变，同时在肥胖PCOS患者更容易加剧脂、糖代谢紊乱。进一步观察PCOS患者的血清apelin表达，发现PCOS患者apelin50140(9866)pml】明显高于健康对照组41677(6107)pgm1，差异有统计学意义；PCOS肥胖组血清28重庆医科大学博士研览生学位论文apelin52080(10027)
11、pgm1与非肥胖组患者血清apelin49728(9869)pgm1分别与对照组比较，差异均有统计学意义；PCOS患者血清apelin水平呈高表达，与以前相关PCOS报道一致41。进一步相关性分析发现PCOS患者中apelin水平与BMI、WHR、TG、HOMAIR、Ins、FBG成正相关，与HDL成负相关。以上结果均表明在PCOS患者肥胖及正常体重患者血清中apelin水平均增高，其肥胖、脂糖代谢、IR与apelin高表达有关。那么增高的apelin水平对PCOS患者的病理生理有怎样的影响?目前已知apelin是新发现的脂肪因子，同时apelin也是一个心血管活性多肽，对血管可起扩张、收缩双
12、重效应，研究发现其可激活蛋白激酶B(又名Akt)路径，并激活内皮来源的NO引起血管舒张，又可直接作用于平滑肌细胞导致起血管收缩，apelin对大鼠体内血管起舒张效应并可使血压下降131；但有研究发现在离体去内皮的隐静脉中，apelin可直接与血管平滑肌上的APJ受体结合，肌球蛋白轻链被刺激后引起血管出现收缩效应【141。由此我们推断apelin对血管平滑肌的直接效应可能是收缩而非扩张，但在有完整的内皮存在时，血管内皮细胞上的APJ受体经自分泌形式激活，导致NO等扩血管物质的释放，从而拮抗和掩盖了apelin的直接缩血管效应，而在内皮血管系统受损状态下apelin可能直接表现为血管收缩效应。此外
13、有研究发现发现apelin可以促进自发永生视网膜脉络膜内皮细胞株的细胞迁移、增殖以及毛细血管状管道生成1151。活体内应用基质胶栓的方法检测apelin与血管发生关系，在基质胶内包埋lnM apelin，发现有毛细血管生成，栓中血红蛋白含量增高，以上说明apelin可能是一种新的内皮细胞上血管源性生长因子，可以促进新血管的形成，在代谢性疾病中的高表达可能与其相关的微血管病变有关161。因此，我们推测患者IR程度直接影响血浆胰岛素水平增加，导致血浆apelin动态平衡被破坏而使其浓度升高，增加的apelin可能会促进前脂肪细胞的增加或者脂肪组织微血管的生成，进一步导致脂肪细胞的聚集，加剧IR。这
14、种恶性循环长期存在，血管内皮受损状态加剧，apelin扩血管主要与内皮完整性相关，因此当内皮受损持续后，apelin表现为直接的缩血管作用，并可能加剧血管相关并发症的进一步发展。在PCOS患者中由于肥胖、异常脂糖代谢特别是IR和性激素紊乱这些都成为血管内皮功能受损危险因素。有研究表明年轻PCOS患者存在隐匿性心血管不良改变【17】，当这些患者到中年以后其心血管疾病风险明显高于同龄对照者181。我们推测增高的apelin可能会导致PCOS患者血管内重庆医科大学博士研究生学位论文皮损伤进一步发展，加重远期PCOS患者高血压、糖尿病、动脉粥样硬化的发生。此外，最近研究发现在牛卵泡发育中apelin在
15、卵颗粒细胞表达，APJ在牛内膜细胞及颗粒细胞上均表达，apelin可能参与卵泡发育19201，为研究脂肪因子与卵泡发育提供了新的研究思路。ApelinAPJ在卵巢上表达如何?PCOS患者特别是肥胖或IR状态下增高的apelin是否参通过旁分泌或自分泌方式作用于卵泡发育?目前还未见相关报道，值得进一步探讨。4小结41 PCOS患者血清apelin水平明显高于正常对照组；肥胖PCOS患者血清apelin水平明显高于非肥胖PCOS患者。42 PCOS患者血清apelin水平与HOMA-IR、BMI、WHR、Ins、FBG成正相关，与HDL成负相关，提示apelin可能参与PCOS发病及临床症状发生。30
