1、穿心莲内酯对巨噬细胞炎症因子表达的影响作者：李明,陈伟强,胡太平,张丽蓉,蔡尤彪,古宏标【摘要】 目的 研究穿心 莲内酯对小鼠巨噬细胞氧化亚氮(NO) 、肿瘤坏死因子(TNF ) 和白 细胞介素 6(IL 6) 生成的影响。方法 培养小鼠巨噬细胞 RAW264.7，分别加入脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS，终质量浓度 1 g/mL)和不同浓度的穿心莲内酯(终浓度 1、10、50 mol/L)进行干预，并 设空白组和穿心莲内酯单独作用组作为对照。取培养 24 h 细胞上清，用 Griess 法检测 NO 产量;用 Elisa 法检测TNF 、IL 6 浓度。结果 与空白组比
2、较，LPS 明显促进了RAW264.7 细胞 NO、TNF 、IL 6 等炎症因子的生成;穿心莲内酯单独作用不影响炎症因子的表达，但穿心莲内酯能显著下调 LPS 诱导的炎症因子表达，与 LPS 组差异有显著性。 结论 穿心莲内酯可明显降低 LPS 诱导的巨噬细胞炎症因子表达，抑制炎症反应。 【关键词】 穿心莲内酯;巨噬细胞;炎症因子;内毒素)Abstract:Objective To investigate the inhibitive effects of andrographolide on lipopolysaccharide induced inflammation factors s
3、ecretion in macrophage cells.Methods A macrophage cell line RAW264.7 cells were cultured in vitro,and treated with different concentration of andrpgrapholide in the presence or absence of lipopolysaccharide (LPS). The production of inflammatory factor nitric oxide (NO),tumor necrosis factor (TNF ) a
4、nd interleukin 6 (IL 6) in the supernatant was measured by Griess reagent and Elisa,respectively.Results After stimulated with LPS,the content of NO,TNF and IL 6 were markedly up regulated. Pretreated with andrographolide significantly inhibited LPS induced inflammation factors expression levels,whi
5、ch was statistically significant compared with LPS group(P0.05).Conclusion These results indicated that andrographolide might effectively blocks inflammation by down regulating production of NO,TNF and IL 6.Key words:andrographolide;macrophage cells; inflammation factor; lipopolysaccharide目前，炎症在心血管疾
6、病、肿瘤中的促进作用日渐受到重视，抑制炎症反应防治心血管疾病及肿瘤成为研究的重点1-2。穿心莲为爵床科植物穿心莲属植物穿心莲干燥地上部分，作为常用中药，具有清热解毒、凉血消肿等功效。穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分，有研究表明，穿心莲内酯有显著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加，还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的抗炎作用3。炎症反应时，巨噬细胞在细菌及其内毒素的刺激下，分泌大量的炎症因子，如氧化亚氮(NO)、TNF 和IL 1 等，这些炎症因子又可以进一步活化巨噬细胞，形成 恶性循环，加重炎症反应。本研究通过观察穿心莲内酯对 NO、TNF 和 IL 1等
7、炎症因子表达的影响，探讨其抗炎活性。1 材料与方法1.1 试剂与仪器穿心莲内酯(四川广汉市维康植化有限公司 );细菌内毒素(LPS，E coli Serotype 055:B5，美国 Sigma 公司);NO 检测试剂盒(南京建成生物公司);TNF 、IL 6 Elisa 检测试剂 盒( 美国 RD 公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM 培养基(美国 Gibco 公司);酶标仪(美国 Bio Rad 公司)。1.2 细胞培养及干预实验小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞由本室保存。用完全 DMEM 培养基(含体积分数 10%胎牛血清、质量浓度 100 U/mL 青霉素和 100 g/m
8、L 链霉素 )，体 积分数 5%CO2，37 条件下传代培养。取生长状态良好的 RAW264.7 细胞，质量分数 0.25%胰酶消化，用 DMEM 培养基调整细胞浓度为 1106/mL，接种到 24 孔培养板内，待细胞生长至 80%融合后，加入不同浓度的穿心莲内酯 (终浓度分别为 1、10、50 mol/L)孵育 1 h，然后加入 LPS(终质量浓度 1 g/mL)进行刺激。实验分组：正常对照组、穿心莲内酯单独作用组、LPS 组和穿心莲内酯加LPS 组。1.3 NO 浓度测定细胞加入刺激物后培养 24 h，收集各处理组细胞培养上清液，用硝酸还原酶法检测炎性介质 NO 的浓度。操作步骤按试剂盒说
9、明书完成。1.4 细胞因子浓度测定细胞加入刺激物后继续培养 24 h，收集各 处理组细胞培养上清液，用 TNF 和 IL 6 Elisa 试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。1.5 统计分析所有数据以s 表示，采用 SPSS 11.0 统计软件对实验结果进行Students t 检验， P0.05 为差异有显著性。2 结果2.1 穿心莲内酯对 LPS 诱导巨噬细胞 NO 生成的影响收集 24 h 细胞培养上清，用 Griess 法测定细胞上清中 NO 的含量。结果见表 1。结果显示， 50 mol/L 穿心莲内酯单独作用并不影响巨噬细胞 NO 的表达 (与正常对照组比
10、较，P0.05);1 g/mL LPS刺激可以显著诱导巨噬细胞 RAW 264.7 产生 NO，而穿心莲内酯预干预能明显抑制 LPS 引起的 NO 的释放，并在 150 mol/L 浓度范围内呈剂量依赖性。表 1 穿心莲内酯对 NO 分泌的影响2.2 穿心 莲内酯对 LPS 诱导巨噬细胞 TNF 、IL 6生成的影响结果见表 2。Elisa 检测结果显示，在正常情况下巨噬细胞RAW264.7 培养上清中 TNF 、IL 6 含量极低，50 mol/L 浓度的穿心莲内酯单独作用对其表达也无明显影响(与正常对照组比较，P0.05)。当用 1 g/mL LPS 刺激后，巨噬细胞 TNF 和 IL 6
11、 的表达均明显增高，与正常对照组比较，P0.01。用穿心莲内酯预处理能够抑制 LPS 诱导的炎症反应，穿心 莲内 酯各处理组TNF 、IL 6 浓度均明显低于 LPS 组，两者比较差异有显著性。3 讨论近年来，炎症在多种疾病中，尤其是心血管疾病和肿瘤中的作用引起了广泛的关注。根据在动脉粥样硬化斑块有多种炎性细胞和炎症因子存在等证据，Ross 明确提出了动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的“炎症学说”，指出慢性炎症反应是 AS 的主要发病机制4。随后的研究证实，进入血管壁的巨噬细胞可被氧化型低密度脂蛋白、革兰阴性菌及其 LPS 活化，通 过 NF B、iNOS 和 COX等途径
12、产生 TNF 、IL 6、NO、PGs 等多种炎症介质，促进 AS 斑块的形成和发展，而抑制炎症反应可改善 AS 病变程度，进一步说明了炎症在 AS 中的关键性作用5。炎症与肿瘤的关系很早就引起了人们的关注。现代研究认为，炎症细胞主要通过分泌IL 1、IL 6、TNF 、NO、PGs 及活性氧等炎症因子，参与组成肿瘤微环境，影响肿瘤的进程。这些炎症因子不仅能诱导正常细胞的恶性病变，还可以促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤血管形成，在肿瘤发生发展中有重要作用6。2009 年，Mantovani 在 Nature 杂志上提出，与无限制性生长、转移等特征一样，炎症性微环境与肿瘤关系密切，并认为
13、炎症是肿瘤的 7 大重要标志之一2。 表 2 穿心莲内酯对 TNF 和 IL 6 表达的影响与正常对照组比较：*P0.01;与 LPS 组比较：#P0.05，#P0.01 目前，国内外研究者都在积极寻找抗炎药物，对心血管疾病和肿瘤进行防治研究工作1,7-8。我国传统中药，尤其是清热解毒中药很多具有抗炎作用，发挥中药资源在抗炎症方面的优势，寻找有效的抗炎中药，防治危害人类健康的重大疾病是中药现代化开发的需要。穿心莲内酯是清热解毒代表中药穿心莲的主要药效成分。以往研究证实，穿心莲内酯有显著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加，还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的
14、抗炎作用3，但对其细胞及分子机制并不清楚。本研究以穿心莲内酯为研究对象，初步观察了其对炎症因子NO、TNF 和 IL 6 表达的影响。实验结果 显示，LPS 刺激可以诱导巨噬细胞大量表达炎症因子 NO、TNF 和 IL 6，而穿心莲内酯预处理则可以减轻 LPS 引起的炎症反应，减少巨噬细胞炎症因子的表达。有研究显示穿心莲内酯可以阻碍 NF B 与 DNA 的结合，抑制NF B 下游基因的转录9。iNOS、TNF 、IL 6 等基因的表达都受到 NF B 的调控，因此推测穿心莲内酯抑制炎症因子表达可能与降低 NF B 信号分子活性有关。本研究结果显示，穿心莲内酯能降低LPS 诱导的巨噬细胞炎症因
15、子 NO、TNF 和 IL 6 生成，抑制炎症反应，为穿心莲内酯应用于动脉粥样硬化、肿瘤等炎症相关性疾病的治疗提供了理论基础。【参考文献】1 VAN DER HEIDEN K,CUHLMANN S,LUONG LE A,et al. Role of nuclear factor kappaB in cardiovascular health and diseaseJ. Clin Sci (Lond),2010,118(10):593-605.2 MANTOVANI A. Cancer: Inflaming metastasisJ. Nature,2009,457(7225):36-37.3 何
16、恩其,赵烽. 穿心莲的药理作用及其研究进展J. 中医药导报,2007,13(50)：107-1084 ROSS R. Atherosclerosis is an inflammatory diseaseJ. Am Heart J,1999,138(5 Pt 2):S419-S420.5 MAHMOUDI M,CUIZEN N,GALLAGHER P J. Athero genesis: the role of inflammation and infectionJ. Histopathology,2007,50(5):535-546.6 CLEVERS H. At the crossroads
17、 of inflammation and cancerJ. Cell,2004,118(6):671-674.7 LEE C H,JEON Y T,KIM S H,et al. NF kappaB as a potential molecular target for cancer therapyJ. Biofactors,2007,29(1):19-35.8 BAUD V,KARIN M. Is NF kappaB a good target for cancer therapy? Hopes and pitfallsJ. Nat Rev Drug Discov,2009,8(1):33-40.9 HIDALGO M A,ROMERO A,FIGUEROA J, et al. Andrographolide interferes with binding of nuclear factor kappaB to DNA in HL 60 derived neutrophilic cellsJ. Br J Pharmacol,2005,144(5):680-686.
