1、组培实验-实验二 外植体的灭菌、接种与初代培养一、实验目的通过实验初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。二、实验原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。三、实验材料、试剂和仪器设备1实验材料：喜树当年生枝条2试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：4瓶培养基，一个无菌烧杯+吸水纸，1升无菌水，大号、中
2、号镊子各1把，1把解剖刀、1把剪刀，2个500ml 烧杯非无菌材料：0.1%升汞消毒液200ml，1个250ml 消毒缸，1盏酒精灯及火机1个，1个烧杯，内装75%酒精150ml，1个烧杯，内装75%酒精及棉球，1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷，橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、喷雾器四、实验步骤1实验一制备的培养基即是本实验所用培养基。2接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通
3、风20min 后，即可进行无菌操作。3选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好） 。将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。吸干水份后切成约2-3cm 的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。4进入接种间，用酒精棉球仔细擦拭双手至手腕部位5把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌镊子将已完成表面灭菌的外植体转移到烧杯中，用无菌水清洗5次，每次
4、不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。最后一次清洗后将外植体转移到无菌烧杯上，吸干水分备用。6接种时，将消毒后的外植体首尾切除（中间至少有一芽） ，再按极性方向用镊子接种到培养基上，接种时，每一次操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中，再将器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。每瓶可接入34段喜树茎段。7.每瓶接种完毕后，将瓶口置火焰上转动烧烤，以杀死瓶口上的细菌，再封好瓶口，贴上标签。8，接种完后清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30分钟。9.将培养瓶放置在212，光强8001200lx，光周期为12h 的环境下培养。每周观察一次，将污染的外植体拿走洗掉。五注意事项1.接种过程中，及时盖好切割好的外植体的培养皿，防止污染外植体。2.接种员双手不能离开工作台，不能说话，咳嗽，走动等.3.消毒时注意安全
