1、布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管 Eos 和 STAT6 表达的调控作用【摘要】 目的 研究布地奈德(BUD)对支气管哮喘大鼠支气管 Eos 和 STAT6 表达的调控作用。方法 30 只清洁级幼年健康雄性 Wistar 大鼠经造模后，随机分为对照组、哮喘组和 BUD 组。实验结束后对支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织匀浆进行细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数和分类计数；应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定血清中 IL-4 的含量；采用免疫组化法检测 STAT6 蛋白表达的变化。结果 (1) 哮喘组 BALF 中细胞总数、EOS 绝对值和 EOS 占细胞总数的百分比(EOS)均显著高于对
2、照组(P001) ，BUD 组BALF 中上述各 项指标较 哮喘组均显著降低 P0.01)；(2)BALF 中IL-4 的浓度哮喘组显著高于对照组(P0 01)，BUD 组较哮喘组显著降低(P0.01)，而 IL-4 的浓度哮喘组显 著低于对照组(P0.01) ，BUD 组较哮喘组显著升高 (P0.01)；(3) 哮喘组支气管上皮细胞STAT6 蛋白阳性表达较对照组明显增强(均为 P0.01)，BUD 组较哮喘组明显减弱(均为 P0.01)。结论 哮喘大鼠支气管 STAT6 较强表达，上皮细胞是其主要表达细胞；BUD 有抑制气道炎症的作用，下调 STAT6 及其基因表达，使 IL-4 合成减少
3、可能为其重要作用机制。 【关键词】 布地奈德 哮喘 信号转导子和转录激活子 6(STAT6) IL-4 支气管哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的主要慢性疾病之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，已引起世界各国学者的高度重视和广泛关注，哮喘已成为患者家庭及社会一个沉重负担。哮喘时由于变应原，细胞因子等的诱导，导致 STAT6 的持续活化，过度表达，促进Th2 的募集，增殖和优势表达 IL-4，IL-3 等 Th2 型细胞，使 Th1/Th2比例失衡，通过 STAT6 诱和趋化 EOS 等细胞向气道的炎症部位聚集，引起气道炎症反应和 AHR，因此 STAT6 有望成 为治疗哮喘的有效靶分子，研究针对
4、STAT6 的拮抗剂或抑制剂，通过调控 STAT6 所介导的信号转导系统来调控免疫系统，将为临床治疗哮喘开辟新的途径。 1 材料与方法 1.1 材料 实验动物 一级（普通级）健康雄性 Wistar 大鼠，56 周龄，30 只，体重200220g，由佳木斯大学医学院实验动物中心提供。 1.2 方法 1.2.1 实验设计和分组 将 30 只 Wistar 大鼠根据随机数字表法随机分 为 3 组：OVA 致敏及激发哮喘模型组、BUD 干预组、正常对照组，每组 10 只。 1.2.2 实验试剂及材料 卵白蛋白（OVA）美国 sigma 公司（进口分装）；液态铝（Alum)美国PIERCE 公司（批号
5、20090222）；布地奈德雾化液(BUD)澳大利亚阿斯利康公司（批号 20090516）；大鼠用 STAT6 免疫组化检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2.3 动物模型制作 （1）致敏及激发哮喘阶段：参考苗会、薛全福等1人的研究报道制作哮喘模型，模型组大鼠在实验第 1 天于腹腔注射致敏原（含0.01OVA0.1ml 及液态铝 0.1ml，充分混匀 30min），之后于实验第 8天及第 15 天腹腔注射加强致敏，注射量相等，共 2 次。实验第 22 天起将大鼠置于自制 45cm30cm25cm 有机玻璃箱中雾化吸入1OVA 溶液 4ml 激发哮喘，每天一次，每次 30min，持
6、续 7 天。正常对照组用等量 NS 替代 OVA。 （2）BUD 干预阶段：布地奈德 组大鼠同模型 组致敏及激发，激发前 30min 给予 0.2mgBUD 雾化吸入，每天一次，每次 30min，持续 7天。模型组、正常 对照组用等量 NS 代替，持 续时间相等。 1.2.4 动物处理 各组大鼠于最后一次雾化激发 12 小时以 1000u/ml 肝素 0.2ml 腹腔注射抗凝，1戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，眼球放血、 颈椎脱臼法处死大鼠，采集标本。 1.2.5 试验指标采集与测定 （1）取血清：大鼠麻醉后用 1000u/ml 肝素 0.2ml 腹腔注射抗凝，用弯镊摘取双侧眼球取血
7、约 1ml，血液用低速离心机以 2000r/min 速度离心 20min，取血清，-20保留，用 ELISA 法测定血清中 IL-4 水平。 （2）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）：取血完毕后，即刻行气管插管左肺支气管肺泡灌洗生理盐水 5ml6,回收肺泡灌洗液(BALF), 回收率90%。取 BALF 回收液 3ml 经双层无菌纱布过滤,在 4、1200 r/min 离心 10min 分离细胞。离心沉淀细胞用生理 盐水冲洗并调整细胞数为 1.0109/L,在细胞计数板上计数细胞总数。取已调整细胞数的BALF 30L,用特制的 细胞涂片离心支架在 4、1200 r/min 离心 10 min,通
8、过离心作用使一定量 细胞均匀平铺于载玻片上,冷风吹干,经HE 染色后在高倍镜下计数 100 个细胞,同时进行细胞分类计数,每例动物计数 3 张涂片。 （3）肺组织收集及处理 支气管肺泡灌洗后迅速打开胸腔，取出左肺，蒸馏水冲洗，无菌处理，于 4多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行 HE 染色和STAT6 免疫组化检测。 1.3 STAT6 表达的测量方法 采用图像分析仪对图像进行分析。每张切片在光学显微镜下放大400 倍，随机选择至少 5 个高倍视野后，测定着色细胞平均吸光度(OD)，计算其平均 值作 为该切片的代表值。 1.4 统计学处理 数据均以均值标准差（ x-s)表示，统计学处理采用
9、 SPSS 11.5 软件进行单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用 LSD 检验,单个样本前后比较采用配对 T 检验，取 P0.05 为有统计学意义，P0.01 为有 显著差异。 2 结果 2.1 症状观察 模型组所有大鼠致敏激发后都出现烦躁不安、易惊、抓耳挠腮、毛发倒伏、大小便增多、呼吸增快、口唇发绀、腹部 痉挛、弓背、最后伏俯不动等急性过敏反应，而治疗组及正常组相对较安静。所有大鼠无死亡。 2.2 各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分比较 哮喘组及 BUD 组大鼠 BALF 中细胞总数，嗜酸性粒细胞（EOS）和中性粒细胞（N）占总白细胞的百分比均高于正常对照组（P0.05）；而 BUG 组
10、BALF 中白细胞总数、EOS%和 N%均低于哮喘组组（P0.05），但仍高于正常对照组（P0.05）。见表 1。 表 1 各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分组成（x-s）注：与正常组比较,*P0.05；与模型组比较，P0.05 2.3 各组大鼠 BALF 中 WBC 总数及 Eos 比例比较 大鼠 BALF 中，模型 组 WBC 总数及 Eos 百分比较正常组明显增高，差异有显著性意义（P0.01）；治疗组 WBC 总数及 Eos 百分比较A 组明显降低，差异有显著性意义（P0.01）；治疗组 WBC 总数虽稍高于正常组，但无明显差异（P0.05），治 疗组 Eos 百分比仍较正常组高，差异有统计
11、学意义（P0.05）， 见表 2。 表 2 各组大鼠 BALF 中 WBC 总数及 Eos 比例比较(x-s)注：与正常组相比较P0.05 P0.01，与模型组相比较P0.01 2.4 各组大鼠血清中 IL-4 的含量比较(x-S) 大鼠血清中 IL-4 的含量，模型组血清中 IL-4 的含量较正常组明显增高，差异有显著性意义（P0.01）；治疗组血清中 IL-4 的含量较模型组明显降低，差异有显著性意义（P0.01），但治疗组血清中 IL-4的含量仍较正常组高（P0.01），见表 3。 表 3 各组大鼠血清中 IL-4 的含量比较(x-S)注：与正常组相比较0.01，与模型组相比较P0.01
12、 2.5 各组大鼠 STAT6 表达的比较 大鼠气管的 STAT6 表达，模型组 STAT6 表达较正常组明显增高，差异有显著性意义（P 0.01）；治疗组 STAT6 表达较模型组明显降低，差异有显著性意义（P 0.01），但治疗组 STAT6 表达较正常组仍高（P0.01），见表四。 表四 各组大鼠支气管 STAT6 的表达结果的比较(x-S)与正常组比较P 0.01 与模型组比较P 0.01 3 讨论 支气管哮喘是多基因遗传和环境因素相互作用的变态反应性疾病，各种因素包括 Eos、T 淋巴细胞、气道上皮细胞等及其分泌的几十种细胞因子共同参与引起气道慢性炎症，继而气道高反应性和可逆性气流受
13、限。临床上使用糖皮质激素治疗哮喘可以明显减轻哮喘的症状，减少发作次数和改善肺功能，疗效已得到肯定。其作用可能是通过抑制淋巴细胞与巨噬细胞及其分泌的多种细胞因子的合成，抑制 Eos 的趋化与活化，减少白三烯和前列腺素的合成并抑制其代谢，促使小血管收缩、增高其内皮的紧密度、减少血管渗漏，抑制炎症细胞趋化，活化并提高呼吸道平滑肌 2 受体的反应性和增加细胞膜上 2 受体的合成，抑制组胺酸脱羧酶、减少组胺的形成，增加 PGE 受体的数量，抑制支气管腺体中酸性黏多糖的合成，减少血浆素原激活剂的释放及弹性蛋白酶和胶原酶的分泌等2，从而抑制炎症反应和延缓气道重塑，使哮喘的临床症状得以控制。 目前关于糖皮质激
14、素作用机制的研究达到分子水平，认为这种小分子脂溶性物质容易通过细胞膜进入细胞内，与胞质中的受体结合，活化的激素受体复合物随后转移至细胞核，链接在糖皮质激素敏感基因启动子区的应答元件 DNA 位点， 调控 DNA 的转录和蛋白质合成，从而发挥其生物学效应。Soe 等3研究发现，糖皮质激素可调控靶基因的转录，抑制 STAT6 的磷酸化及减少 STAT6 与 CD23 启动子结合，从而抑制 IL-4 的分泌， 并通过下调 JAK1 及 STAT6 表达抑制 IL-4和 IL-13 的进一步升高，防止气道上皮细胞的增生，杯状细胞化生和黏液合成增加，气道上皮下胶原沉积减少，-SMA 表达下调，从而控制哮
15、喘气道重塑的进展4。但也有实验提出， 吸入糖皮质激素并不能用于防止气道重塑5。而 Heller 等6 也发现，气道上皮细胞STAT6 表达、激活、核转移以及与靶基因结合均不受糖皮质激素的影响。本实验中作者发现，地塞米松组与哮喘组小鼠相比，气道及肺组织中 STAT6 表达明显减少， 该过程伴随着 动物 BALF 中白细胞、Eos 的减少，气道炎性浸润减轻，杯状细胞减少等，提示治疗有效，与文献报道是一致的，证实了 STAT6 信号转导途径在调控变应性疾病的基因表达方面起重要作用。 本实验研究显示哮喘模型组 BALF 中 WBC 总数、Eos 比例均明显高于正常对照组，经 BUD 干预治疗后 BAL
16、F 中 WBC 总数、Eos 比例明显降低，BALF 中 WBC 总数与正常对照 组接近，但 BALF 中Eos 比例仍高于正常对照组，提示雾化吸入 BUD 可以抑制哮喘大鼠Eos 的产生。提示气道炎症一旦形成，可能需要较长时间来控制。有研究也表明哮喘患者尽管吸入激素或口服激素，气道粘膜 Eos 性炎症仍持续存在，这与临床上哮喘的患者需要长期吸入激素来控制哮喘变态反应性炎症相符。 本实验中，从肺组织病理观察结果提示 BUD 具有抗炎作用，能减轻粘膜水肿，减轻支气管痉挛，从而减轻 AHR 及气道重塑。 综上所述，BUD 雾化吸入能显著改善哮喘大鼠的症状及气道炎性病理变化，抑制炎性细胞的表达，其具
17、体的作用机制有待进一步研究。= 参 考 文 献 1 苗会, 薛全福,庄逢源等.哮喘大鼠动物模型的制备J.基础医学与临床,1998,18(l):72-78. 2Doniec ZAnti inflammatory action of corticosteroids in bronchial asthma mechanism of action and pathophysiologic aspects J.Pncumonol Alergol Pol，1997，65(Suppl1)：66-70 3Soe Y，Kim SH，Park HH，et a1Corticosteroid inhibits IL-
18、4 singaliug through down-regulation of IL-4 receptor and STAT6 activityJ.FEBS Letters，2002,518:53-59. 4 陈晓红 ，钟南山，张卫东等布地奈德对哮喘小鼠气道重塑及JAKI/STAT6 表达的影响 J中华医学杂志，2007,87:1627-1632. 5Panetfier RA. Effects of corticosteroids on structural cells in asthma and chronic obstructive pulmonary diseaseJProc Am Thorac Soc,2004,1:231-234. 6Heller HM,Matsukura S, Georas SN. Assessment of signal transducer and activator of transcription 6 as a target of glucocorticoid action in human airway epithelial cellsJClin Exp Allergy,2004,34:1690-1700.
